Окрашивающие препараты для микроскопа. Техника приготовления микропрепаратов. Исследование микроорганизмов в живом виде

При изготовлении временных микропрепаратов необходимо соблюдать следующую последовательность операций:

1. Вымыть и тщательно вытереть предметное и покровное стекла. Чтобы не сломать очень хрупкое покровное стекло, надо поместить его в складку салфетки между большим и указательным пальцами правой руки и осторожно вытереть его круговыми движениями пальцев.
2. Нанести на предметное стекло пипеткой каплю жидкости (воды, глицерина, раствора, реактива или красителя).
3. Сделать срез изучаемого органа при помощи лезвия. Лезвие должно быть очень острым.
4. Выбрать самый тонкий срез, перенести его с помощью препаровальной иглы или тонкой кисточки в центр предметного стекла в каплю жидкости.
5. Закрыть срез покровным стеклом так, чтобы под него не попал воздух. Для этого покровное стекло взять двумя пальцами за грани и подвести под углом нижнюю грань к краю капли жидкости и плавно его опустить.
6. Если жидкости много, и она вытекает из-под покровного стекла, удалить ее при помощи фильтровальной бумаги. Если же под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, то добавить жидкость, поместив ее каплю рядом с краем покровного стекла, а с противоположной стороны фильтровальную бумагу .

Перед учителями биологии и руководителями кружков рано или поздно встает задача изготовить учебный микропрепарат. Какое же вещество, способное надолго зафиксировать биологический объект, и как сделать эту процедуру простой и доступной. Известные бальзамы (смолы-фиксаторы) никогда не относились к легкодоступным веществам, особенно в удалении от крупных городов. Кроме того, говорят, что вещества эти не безвредны. И, наконец, сам процесс их использования довольно непрост.

Для изготовления препарата можно использовать клей ПВА. Важно, чтобы препарат был влажный, хорошо смоченный, а клей - свежий и чуть разбавленный чистой холодной кипяченой водой до нужной концентрации (клей представляет собою эмульсию и легко разводится). После нескольких проб и ошибок нужную концентрацию получится составлять и определять без труда.

Затем, на чистое предметное стекло наносят каплю воды - кипяченой или дистиллированной. Воду надо аккуратно удалить чистой, не оставляющей волосков тканью или фильтровальной бумагой так, чтобы стекло было чуть влажным. Это, как и влажность образца, способствует равномерному (без пузырьков) смачиванию. На подготовленную поверхность нужно нанести небольшую каплю заранее приготовленного клея ПВА так, чтобы не появились пузырьки воздуха. Они иногда и не мешают, но внешний вид препарата портят. В эту каплю аккуратно переносят заранее подготовленный срез или образец, например, предварительно умерщвленную горячей водой дафнию. Затем плавным наклонным движением надо сверху положить покровное стекло, также чистое и слегка влажное. Слой клея между стеклами должен быть как можно более тонким.

Если что-то не удалось, а образец ценный и достаточно крупный, почти всегда, в отличие от смол, есть возможность его отмыть простой водой и процедуру повторить. Излишки клея аккуратно смываются тонкой струйкой воды; нужно следить, чтобы она не затекала между стеклами. Покровное стекло необходимо придерживать. Чуть мутноватые остатки воды можно аккуратно удалить фильтровальной бумагой или полоской тонкой ткани без ворса. биология микропрепарат приготовление способ

Готовые препараты надо разложить в теплом сухом месте. Индикатором готовности препарата служит его прозрачность. В зависимости от очень многих факторов высыхание до прозрачного состояния продолжается от одной до четырех недель. Бывает, что слишком толстый слой клея или клей, загрязненный примесями, полностью прозрачным не становится - это несколько ухудшает изображение, но благодаря небольшой глубине резкости микроскопа даже такие препараты доступны для изучения.

Нет гарантии, что этот метод можно применять для изготовления любых препаратов, поскольку некоторые из них требуют окрашивания, а красители могут взаимодействовать с клеем .

Т.Н. Лашкина, учитель биологии и экологии средней школы № 23, из г. Сызрань предлагает следующий способ приготовления микропрепаратов. Можно взять обыкновенный желатин, залить его водой для набухания. Затем в столовую ложку набрать немного набухшего желатина (без воды) и нагреть над огнем. Когда желатин разойдется (не надо, чтобы он закипал), капнуть его на предметное стекло. В эту каплю положить образец и закрыть покровным стеклом, хорошо придавить пальцем его для равномерного распределения желатина. Микропрепарат готов.

Вместо покровного стекла можно использовать целлофан, если нет покровных стекол. Кроме того, целлофан имеет одно преимущество: микропрепарат нельзя раздавить, т.к. целлофан эластичен и не трескается, как покровное стекло.

С желатином надо работать быстро, иначе он застывает. Но если такое случится, то достаточно подержать стекло над огнем - и желатин вновь станет жидким. Желатин безвреден, доступен и очень экономичен .

Для изучения микроорганизмов производят микроскопирование как живых, так и убитых микробов в неокрашенном и окрашенном виде. Микроскопический препарат готовят на предметном стекле - пластинке из тонкого стекла (76х26 мм) с хорошо отшлифованными краями. Предметные стекла, употребляемые при микробиологическом исследовании, должны быть кристально чисты и абсолютно обезжирены. На поверхности обезжиренного стекла вода легко расплывается и не образует капель шаровидной формы.

Новые стекла перед употреблением кипятят в 1%-ном растворе соды 10 мин, промывают водой, слабой соляной кислотой и хорошо прополаскивают в дистиллированной воде. Стекла, бывшие в употреблении, необходимо обработать раствором серной кислоты в течение 2 ч, хорошо промыть в воде и прокипятить 10 мин в 4%-ном растворе соды. Ополоснутые затем дистиллированной водой стекла протирают чистой полотняной тряпочкой.

В лаборатории всегда следует иметь запас готовых для работы стекол. Хранить предметные стекла лучше всего в банке с притертой пробкой, погруженными в смесь спирта с эфиром, взятых в равных объемах. Из банки предметные стекла достают пинцетом. Покровные стекла - вырезанные квадратом или прямоугольником тонкие стеклышки (толщиной 0,15-0,17 мм) размерами 18х18 мм, 20х20 мм, 18х24 мм.

Исследование микроорганизмов в живом виде

Микроорганизмы можно микроскопировать как в живом, так и в мертвом (фиксированном) состоянии на специально приготовленных препаратах. Плесневые грибы и дрожжи лучше рассматривать в живом виде в препарате «раздавленная» капля. Клетки этих микроорганизмов относительно крупные, и обычно при микроскопировании в живом виде хорошо выявляются их форма, размеры, некоторые детали внутреннего строения, а также характер размножения (почкование, деление, спорообразование и т.д.).

Бактерии ввиду их малых размеров чаще рассматривают в мертвом виде на фиксированных окрашенных препаратах. При этом получается более ясное представление о форме и размерах клеток, о способности их к спорообразованию. В живом виде в «раздавленной» капле бактерии рассматривают в том случае, когда выясняют их способность к движению.

Препарат «раздавленная» капля. На обезжиренное предметное стекло прокаленной петлей наносят каплю стерильной воды, в которую той же петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры микроорганизма (дрожжей или бактерий), взятой с твердой питательной среды. Из жидкой среды культуру берут вместе с каплей жидкости, а при надобности добавляют каплю стерильной воды. Суспензия культуры микробов на стекле должна давать лишь слабую муть. При микроскопировании дрожжей в каплю жидкости на стекле добавляют петлей небольшое количество метиленовой сини (до голубого окрашивания) и всю эту смесь тщательно размешивают. Прижизненная окраска дрожжей метиленовой синью применяется для того, чтобы выявить мертвые клетки, легко окрашивающиеся в синий цвет. Живые клетки остаются неокрашенными, так как не пропускают краску через свою оболочку.

Приготовленный на предметном стекле препарат дрожжей накрывают покровным стеклом и рассматривают с объективом 40Х. В таком препарате обычно хорошо видны прозрачные овальные или круглые клетки дрожжей с ядрами и оболочками, которые хорошо заметны в клетках живых дрожжей. Мертвые клетки, как правило, более мелкие по сравнению с живыми м окрашены в синий цвет.

Препарат живых бактерий готовится подобно препарату дрожжей, но бактерии можно рассматривать и без добавления краски. На поверхность покровного стекла наносится капля иммерсионного масла, и препарат рассматривается с иммерсионным объективом 90 X, лучше всего в затемненном поле (т.е. с прикрытой диафрагмой). Если культура бактерий подвижная, то хорошо видны быстрые разнохарактерные движения отдельных клеток.

Для приготовления препарата плесневых грибов очень осторожно (чтобы не разрушить органов спороношения) специальной иглой (можно препаровальной) или ботаническим пинцетом снимают кусочек пленки гриба и переносят его в каплю воды, предварительно нанесенную на предметное стекло. Препарат осторожно, слегка придавливая, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом с объективом 8Х. При этом увеличении хорошо различается строение органов спороношения плесневых грибов. Для подробного изучения отдельных деталей строения (гиф, сумок и т.д.) препарат рассматривают с объективом 40X. При этом обязательно следует регулировать освещение с помощью диафрагмы для получения более четкого изображения рассматриваемых деталей.

При приготовлении препаратов в раздавленной капле нужно помнить следующее:

1. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться его ребром к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить стекло.

2. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не переливалась за края и не попадала на верхнюю сторону покровного стекла. Избыток воды снимают кусочком фильтровальной бумаги.

3. Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под покровным стеклом, обычно не мешают наблюдению. Но если пузырьков много, препарат следует приготовить заново.

4. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микроорганизмы не заслоняли друг друга.

5. Приготовленные препараты рассматривают немедленно (особенно живых бактерий), так как в противном случае вода высыхает и клетки бактерий теряют подвижность.

6. Бактериологическую петлю (или иглу) перед каждым очередным пассажем и после него (нанесение капли воды на стекло, снятие культуры с агара и ее размешивание, взятие краски и т.д.) следует обязательно докрасна прокаливать в пламени горелки.

После прокаливания петлю быстро охлаждают на воздухе (держат 2-3 сек, ни к чему не прикасаясь) и приступают к выполнению очередного этапа работы.

Исследование микроорганизмов в фиксированном и окрашенном виде

Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предметное стекло платиновой петлей наносят материал (рис. 62). Если он жидкий, то каплю, взятую петлей, непосредственно равномерно распределяют по поверхности предметного стекла тонким слоем на площади примерно в 1 см2. Если же изучается агаровая культура, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильной воды, в которой тонким слоем распределяется исследуемая культура. Получается так называемый мазок. Все манипуляции по приготовлению мазка необходимо выполнять с соблюдением правил асептики (над пламенем горелки стерилизуют петли, концы сосудов с исследуемым материалом, ватные пробки и пр.). Сделав мазок, его сушат при комнатной температуре, поместив на специальный сушильный столик (рис. 63). Хороший мазок после сушки должен давать едва заметный налет. Препарат с густым мазком для наблюдения малопригоден.

Для ускорения высыхания можно осторожно подсушить мазок над пламенем горелки. Предметное стекло в этом случае над пламенем горелки держат так, чтобы мазок был обращен вверх.

Фиксация мазка. Предметное стекло с высушенным мазком, обращенным вверх от пламени горелки, проводят 3-4 раза на границе между светлой и темной частью пламени. Цель фиксации - убить микробные клетки, прикрепить их к стеклу и облегчить окрашивание. Мертвые клетки гораздо лучше воспринимают краску, чем живые. Препарат в общей сложности не должен находиться в пламени более 2 сек. Излишнего нагревания мазков нужно избегать, так как при этом сильно изменяется структура клеток, мазок будет плохо окрашиваться. При недостаточной же фиксации мазка его можно смыть при последующей окраске. Практически достаточность нагревания определяют прикладывая предметное стекло к руке. При этом должен чувствоваться легкий ожог.

Окраска мазков. В лабораторной практике пользуются простыми и сложными методами окраски микробов. Сложные, или дифференциальные, способы окраски, как уже указывалось, применяются для детального изучения структуры клеток. При простой окраске препаратов на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо красящего раствора (метиленовой сини, разведенного фуксина и пр.). Для получения более чистых препаратов рекомендуется красящий раствор наливать на отрезок фильтровальной бумаги, которой покрывают мазок. Раствор краски в среднем выдерживают на мазке 2-3 мин (в зависимости от вида краски). Фуксин красит интенсивно, причем окрашиваются одинаково хорошо все виды бактерий. Продолжительность окрашивания раствором фуксина вполне достаточна на протяжении 1-2 мин. Щелочную метиленовую синь оставляют для окрашивания мазка на 2-3 мин. Она красит менее сильно, но препарат получается более изящный, к тому же различные бактерии приобретают окраску различной интенсивности. При окраске метиленовой синью у крупных клеток (например, дрожжевых) дифференцируется ядро и цитоплазма. Раствор генцианвиолета держат для окраски 3-5 мин.

По истечении указанного срока краску сливают с предметного стекла. Если на мазок помещалась фильтровальная бумага, ее нужно осторожно снять пинцетом и затем промыть мазок легкой струей дистиллированной воды (можно и водопроводной). Струю воды следует направлять на ребро предметного стекла, а не на мазок. Промытый препарат высушивают на воздухе при комнатной температуре или с помощью полосок фильтровальной бумаги.

На сухой мазок наносят каплю кедрового масла. Не следует кедровое масло наносить на влажный (а тем более на мокрый) мазок. При этом возникает эмульсия воды в кедровом масле и четкость изображения в микроскопе резко снижается.

Сущность сложных методов окраски заключается в том, что препарат окрашивают не одной, а двумя и большим количеством контрастных красок. В микробиологической практике сложный метод окраски микробов по Граму имеет весьма важное значение при дифференциации микробов.

Техника окраски микробов методом Грама состоит в следующем. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый раствор генцианвиолета на 1-2 мин. Затем краску сливают. Сняв бумажку и не промывая препарат водой, наносят на мазок раствор Люголя также на 1-2 мин (мазок чернеет). По истечении указанного времени раствор Люголя сливают с предметного стекла и погружают стекло в стаканчик со спиртом для обесцвечивания. Предметное стекло слегка покачивают в спирте, выдерживая 30-60 сек. Быстро промывают мазок водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 1-2 мин. Фуксин сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Выполнить окраску микробов по Граму можно, пользуясь модификацией этого метода, предложенной Синевым. Вместо раствора карболового генцианвиолета используют фильтровальную бумагу, пропитанную этим раствором и высушенную. На фиксированный мазок накладывают полоску такой бумаги, наносят несколько капель стерильной воды, так чтобы бумажка оказалась смоченной, и окрашивают препарат в течение 2 мин. Затем бумажку снимают, на препарат наливают раствор Люголя и далее поступают так же, как указано выше при окраске по Граму.

По отношению к окраске по Граму все бактерии разделяют на две группы: грамположительные (грампозитивные) и грамотрицательные (грамнегативные). Первые в результате окраски остаются окрашенными в фиолетовый цвет; вторые - обесцвечиваются спиртом и при дополнительном окрашивании фуксином приобретают красный цвет. Объясняется это тем, что у грамположительных бактерий в цитоплазме клеток содержатся специфические белки и магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которые с генцианвиолетом и йодом образуют комплекс фиолетового цвета, не разрушающийся под действием спирта. У грамотрицательных бактерий магниевая соль рибонуклеиновой кислоты в клетках отсутствует, и такого комплекса при окраске генцианвиолетом и йодом в цитоплазме не образуется. Генцианвиолет и йод в дальнейшем легко обесцвечиваются спиртом.

Приготовление красящих растворов

При бактериологическом исследовании для окраски микробов применяются основные анилиновые краски. Чаще всего употребляются: основной фуксин (красная краска), метиленовая синь (синяя краска), генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет (фиолетовые краски). Эти краски продаются в виде аморфных или кристаллических порошков, из которых готовят красящие растворы.

Исходным материалом для приготовления необходимых рабочих красок являются насыщенные спиртовые растворы указанных красителей. Спиртовые растворы готовят впрок и сохраняют в склянках с притертыми пробками. Сами по себе спиртовые растворы для окраски микробов не применяются.

Насыщенный спиртовой раствор красителя получают растворением 1 г его в 10 мл 96%-ного этилового спирта (этанола). Краска обычно полностью не растворяется, и на дне флакона остается небольшой осадок. Полученный спиртовой раствор настаивают 3-5 дней, ежедневно взбалтывая.

Рабочий водно-спиртовой раствор краски получают смешивая 1 мл насыщенного спиртового раствора с 10 мл дистиллированной воды. Для повышения красящей способности в качестве протравы к водно-спиртовым растворам красок добавляют карболовую кислоту.

Рецепты приготовления наиболее употребительных красок.

Карболовый фуксин Циля. 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина смешивают со 100 мл 5%-ной карболовой кислоты. Можно приготовить красящий раствор и непосредственно из сухого красителя. Для этого 1 г основного фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты. Для лучшего растирания рекомендуется добавить несколько капель глицерина. Затем понемногу приливают 10 мл 96%-ного спирта. К равномерно растертой массе постепенно приливают 100 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на 1-2 суток. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Фуксин Циля стоек и может сохраняться очень долго. Его употребляют для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий, трудно воспринимающих краску.

Фуксин Пфейфера (разведенный фуксин). 1 мл карболового фуксина Циля смешивают с 9 мл дистиллированной воды. Раствор нестоек, поэтому его приготовляют непосредственно перед окраской препаратов. Используют для простой окраски мазков и дополнительной окраски их по методу Грама.

Карболовый генцианвиолет. 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианвиолета смешивают со 100 мл 5%-ной карболовой кислоты или 1 г генцианвиолета растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты, постепенно добавляют 10 мл 96%-ного спирта и 100 мл дистиллированной воды.

Щелочная метиленовая синь (по Лефлеру). К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл 1%-ного раствора едкого кали (КОН). Раствор фильтруют. Краска очень прочная, причем красящая способность старой краски выше, чем свежеприготовленной.

Водный раствор метиленовой сини. 1 г метиленовой сини растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Раствор Люголя. 2 г йодистого калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды, прибавив 1 г кристаллического йода. Объем доводят водой до 300 мл. Раствор Люголя должен иметь слабощелочную или нейтральную реакцию. При кислой реакции его нейтрализуют (по лакмусу) двууглекислой содой. Раствор следует хранить в склянках из темного стекла, предохраняя от действия света.

Приготовление пропитанной генцианвиолетом фильтровальной бумаги для окраски микробов по Граму в модификации Синева. Раствор карболового генцианвиолета помещают на сутки в термостат при 37 °С, затем фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат выливают в тарелку и погружают в него нарезанную полосками фильтровальную бумагу на 1-2 мин. Пропитанная краской бумага подсушивается, нарезается кусочками (2х4 см) и сохраняется в темных склянках с притертой пробкой. Срок хранения неограниченный.

Примечание. Свежеприготовленные карболовые растворы красок имеют на поверхности пленку с металлическим блеском. Эти растворы стойкие и сохраняются довольно долго. Однако при слишком длительном хранении они могут стать непригодными; в этом случае металлический блеск на поверхности их пропадает, а на дне образуется мелкий порошкообразный осадок.

1) Временные препараты

Для изучения растительных объектов с помощью светового микроскопа необходимо приготовить микропрепарат. Микропрепараты, не предназначенные для длительного хранения, называются временными. Изучаемый объект помещают на предметное стекло в каплю воды, глицерина, раствора, реактива или красителя и накрывают покровным стеклом. Такие препараты можно хранить в течение нескольких дней, поместив во влажную атмосферу.

2) Постоянные препараты

Постоянные препараты готовятся по специальным методикам, обеспечивающих их хранение в течение десятков лет. К постоянным препаратам относятся мазки, тотальные препараты и срезы. Мазки используются при изучении клеток крови, культур микроорганизмов, изолированных тканевых клеток. Тотальные препараты представляют собой отдельные прозрачные и тонкие объекты Учебные срезы можно сделать вручную, с помощью бритвы. Однако качественные срезы с заданной толщиной 10...22 микрометра обычно изготавливают с помощью специальных приборов – микротомов. Такие срезы часто называют микротомными препаратами. Для получения более тонких срезов (0,01...0,05 мкм, или 10...50 нанометров) используют ультрамикротомы.

Кратко рассмотрим основные этапы приготовления постоянных препаратов.

1. Фиксация материала. Сразу после окончания фиксации производится промывка материала или водой (после водных фиксаторов), или 80%-ным спиртом (после спиртовых фиксаторов). Количество смен промывных жидкостей – не менее 3. Время – до 24 часов.

2. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации. Параллельно происходит уплотнение материала. Последовательное перемещение материала через ряд растворов называется проводка. После водных фиксаторов используется 8 смен спирта: 20%, 40%, 80%, две смены по 96%, две смены по 100%. После спиртовых фиксаторов – 4 смены спирта: две смены по 96% и две смены по 100%. В каждой смене материал выдерживается по 1 часу.

3. Просветление. Это пропитывание материала растворителем парафина – ксилолом (бензолом, хлороформом). Образец помещается на 1 час последовательно в каждый из последующих растворов: 3 части спирта + 1 часть ксилола, затем 2 части спирта + 2 части ксилола, затем 1 часть спирта + 3 части ксилола, затем две смены ксилола.

4. Заливка в парафин. Это замещение ксилола парафином. Образец помещают в смесь ксилола и парафина при температуре 55...57 градусов и оставляют в термостате при этой температуре до полного испарения ксилола (от нескольких часов до нескольких суток). Затем при температуре 55...57 градусов производится проводка через парафин I (6...12 часов), парафин II (6...12 часов) и заливка в парафин III. Парафины I, II, III отличаются только чистотой: парафин III – это окончательная среда, которая должна обладать наибольшей чистотой. В итоге получаются парафиновые блоки, в которых заключены образцы материала. Эти блоки можно резать в любом направлении.

5. Окрашивание срезов. Парафиновые срезы наклеивают на чистое предметное стекло. В качестве клея можно использовать смесь белка куриного яйца с глицерином (в соотношении 1: 2) с добавлением антисептика (тимола или фенола). Обычно производят депарафинирование срезов. Для этого стекла с наклеенными срезами проводят через ксилол, спирты убывающей концентрации (100%, 96%, 80%, 70%) и дистиллированную воду. Время нахождения в каждой среде – 2...3 минуты. Далее окрашивают согласно методикам.

6. Обезвоживание и просветление окрашенных срезов. Выполняется путем проводки через спирты возрастающей концентрации, а затем через ксилол.

7. Заключение в среды (заливка). Для длительного хранения препаратов их необходимо заключить в среду, предохраняющую препарат от окисления воздухом и от поражения грибками. Для заливки используются специальные смолы (канадский бальзам, пихтовый бальзам), которые растворяют в ксилоле до консистенции жидкого меда. Каплю такого раствора наносят на срез и покрывают покровным стеклом.

6. Химический состав клеточного вещества. Микро и макроэлементы.

В составе клетки обнаружено более 80 химических элементов, при этом каких-либо спеуиальных элементов, характерных только для живых организмов, не выявлено. Однако, только в отношении 27 элементов известно, какие функции они выполняют. остальные 53 элемента, вероятно, попадают в организм из внешней среды.

1. Макроэлементы

Они составляют основную массу вещества клетки. На их долю приходится около 99% массы всей клетки. Особенно высока концентрация четырех элементов: кислорода (65-75%), углерода (15-18%), азота (1.5-3%) и водорода (8-10%). К макроэлементам относят также элементы, содержание которых в клетке исчисляется десятыми и сотыми долями процента. Это, например, калий, магний, фосфор, сера, железо, хлор, натрий.

2. Микроэлементы К ним относятся преимущественно атомы металлов, входящие в состав ферментов, гормонов и

других жизненно важных веществ. В организме эти элементы содержатся в очень небольших количествах: от 0,001 до 0,000001%; в числе таких элементов бор, кобальт, медь, молибден, цинк, йод, бром и др.

3. Ультрамикроэлементы

Концентрация их не превышает 0,000001%. К ним относят уран, радий, золото, ртуть, бериллий, цезий и другие редкие элементы. Физиологическая роль большинства этих элементов в организмах растений, животных, грибов и бактерий пока не установлена.

Лабораторная работа № 1

Тема: «Приготовление и описание микропрепаратов клеток различных организмов».

Цель работы: закрепить умение готовить микропрепараты и рассматривать их под микроскопом, находить особенности строения клеток различных организмов, владеть терминологией темы.

Оборудование: кожица чешуи луковицы, эпителиальные клетки из полости рта человека, культура сенной палочки, стакан с водой, микроскоп, чайная ложечка, покровное и предметное стекла, синие чернила, йод, микропрепараты клеток многоклеточного животного организма, тетрадь, ручка, простой карандаш, линейка,

Ход работы:

Работа 1.

1. Рассмотрите на рисунке последовательность приготовления препарата кожицы чешуи лука.
2. Подготовьте предметное стекло, тщательно протерев его марлей.
3. Пипеткой нанесите 1-2 капли воды на предметное стекло.
4. При помощи препаровальной иглы осторожно снимите маленький кусочек прозрачной кожицы с внутренней поверхности чешуи лука. Положите кусочек кожицы в каплю воды и расправьте кончиком иглы.
5. Накройте кожицу покровным стеклом, как показано на рисунке.
6. Рассмотрите приготовленный препарат при малом увеличении. Отметьте, какие части клетки вы видите.
7. Окрасьте препарат раствором йода. Для этого нанесите на предметное стекло каплю раствора йода. Фильтровальной бумагой с другой стороны оттяните лишний раствор.
8. Рассмотрите окрашенный препарат. Какие изменения произошли ?

9. Рассмотрите препарат при большом увеличении. Найдите на нем хлоропласты в клетках листа, темную полосу, окружающую клетку, оболочку; под ней золотистое вещество - цитоплазму (она может занимать всю клетку или находиться около стенок). В цитоплазме хорошо видно ядро. Найдите вакуоль с клеточным соком (она отличается от цитоплазмы по цвету).

10. Зарисуйте 2-3 клетки кожицы лука. Обозначьте оболочку, цитоплазму, ядро, вакуоль с клеточным соком.
В цитоплазме растительной клетки находятся многочисленные мелкие тельца - пластиды. При большом увеличении они хорошо видны. В клетках разных органов число пластид различно.
У растений пластиды могут быть разных цветов: зеленые, желтые или оранжевые и бесцветные. В клетках кожицы чешуи лука, например, пластиды бесцветные.

Работа 2.

1. Приготовьте микропрепарат бактерии сенной палочки.

2. Рассмотрите препараты под микроскопом.

3. Рассмотрите готовые микропрепараты клеток многоклеточного животного организма.

4.Сопоставьте увиденное с изображением объекта на рисунке.

Работа 3

Рассмотрите готовые микропрепараты клеток многоклеточных животных
Сопоставьте увиденное с изображением объекта на рисунке.

3. Обозначьте органоиды клетки, изображенные на рис. 4

Лабораторная работа № 2

Тема: “Наблюдение явления плазмолиза и деплазмолиза”

Цель: убедиться в существовании явления плазмолиза и деплазмолиза в живых клетках растений и скорости прохождения физиологических процессов.

Оборудование: микроскопы, предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, стаканы с водой, фильтровальная бумага, раствор поваренной соли, репчатый лук.

Ход работы

Снимите нижнюю кожицу чешуи лука (4мм 2);
Приготовьте микропрепарат, рассмотрите и зарисуйте 4-5 клеток увиденного;
С одной стороны покровного стекла нанесите несколько капель раствора поваренной соли, а с другой стороны полоской фильтровальной бумаги оттяните воду;
Рассмотрите микропрепарат в течение нескольких секунд. Обратите внимание на изменения, произошедшие с мембранами клеток и время за которое эти изменения произошли. Зарисуйте изменившийся объект.
Нанесите несколько капель дистиллированной воды у края покровного стекла и оттяните ее с другой стороны фильтровальной бумагой, смывая плазмолизирующий раствор.
В течение нескольких минут рассматривайте микропрепарат под микроскопом. Отметьте изменения положения мембран клеток и время, за которое эти изменения произошли.
Сопоставьте увиденное с изображением объекта на рисунке 1.
Зарисуйте изучаемый объект.
Сделайте вывод в соответствии с целью работы, отметив скорость плазмолиза и деплазмолиза. Объясните разницу в скорости этих двух процессов.

Ответьте на вопросы:

1. Куда двигалась вода (в клетки или из них) при помещении ткани в раствор соли?

2.Чем можно объяснить такое направление движения воды?

3. Куда двигалась вода при помещении ткани в воду? Чем это объясняется?

4. Как вы думаете, что бы могло произойти в клетках, если бы их оставили в растворе соли на длительное время?

5. Можно ли использовать раствор соли для уничтожения сорняков?

6. Дайте определение терминам – плазмолиз, деплазмолиз, осмос, тургор.
7. Объясните, почему в варенье яблоки становятся менее сочными?

Рис 1. Плазмолиз и деплазмолиз

Лабораторная работа № 3

Тема: «Сравнение строения клеток растений и животных, грибов, бактерий».

Цель: научитьсянаходить особенности строения клеток различных организмов, сравнивать их между собой; владеть терминологией темы.

Оборудование: микроскопы, предметные и покровные стекла, стаканы с водой, стеклянные палочки, лист растения элодеи, дрожжи, культура сенной палочки, микропрепараты клеток многоклеточных животных.

Работа 1.

1.Приготовьте препарат клеток листа элодеи. Для этого отделите лист от стебля, положите его в каплю воды на предметное стекло и накройте покровным стеклом.
2. Рассмотрите препарат под микроскопом. Найдите в клетках хлоропласты.
3. Зарисуйте строение клетки листа элодеи. Сделайте надписи к своему рисунку. 4.Рассмотрите рисунок 1. Сделайте вывод о форме, размерах клеток разных органов растений

Рис. 1. Окраска, форма и размеры клеток разных органов растений

Работа 2.

1.Снимите чайной ложечкой немного слизи с внутренней стороны щеки. 2. Поместите слизь на предметное стекло и подкрасьте разбавленными в воде синими чернилами. Накройте препарат покровным стеклом. 3. Рассмотрите препарат под микроскопом.

Работа 3

Рассмотрите готовый микропрепарат клеток многоклеточного животного организма.

2. Сопоставьте увиденное на уроке с изображением объектов на таблицах.

Сравните между собой эти клетки.
Результаты сравнения занесите в таблицу 1

Ответьте на вопросы:

В чем заключается сходство и различие клеток?
Каковы причины сходства и различия клеток разных организмов?

Практическая работа

Тема: «Составление простейших схем скрещивания».

Цель: научиться выписывать типы гамет, образуемые организмами с заданными генотипами; кратко записывать условие генетических задач; решать ситуационные задачи по генетике; использовать навыки генетической терминологии.

Оборудование: учебник, тетрадь, условия задач, ручка.

Ход работы:

Задание 1

Выпишите все типы гамет, образуемые организмами, имеющие следующие генотипы: ААbb, Aa, MmPP, PPKk, AabbCc, AabbCcPP, AaBbCc.

Выписывая гаметы, необходимо помнить, что у организма, гомозиготного по одному (АА) или нескольким (ААbbcc) генам, все гаметы одинаковы по этим генам, так как несут один и тот же аллель.

В случае гетерозиготности по одному гену (Аа) организм образует два типа гамет, несущие разные его аллели. Дигетерозиготный организм (АаВb) образует четыре типа гамет. В целом организм образует тем больше типов гамет, чем по большему числу генов он гетерозиготен. Общее число типов гамет равно 2 в степени n, где n- число генов в гетерозиготном состоянии. Выписывая гаметы, необходимо руководствоваться законом «чистоты» гамет, в соответствии с которым каждая гамета несет по одному из каждой пары аллельных генов.

Задание 2

Научитесь кратко записывать условие генетической ситуационной задачи и ее решение.

При краткой записи условия генетической задачи доминантный признак обозначают прописной (А), а рецессивный – строчной (а) буквой с обозначением соответствующего варианта признака. Генотип организма, имеющего доминантный признак, без дополнительных указаний на его гомо- или гетерозиготность в условии задачи, обозначается А?, где вопрос отражает необходимость установления генотипа в ходе решения задачи. Генотип организма с рецессивными признаками всегда гомозиготен по рецессивному аллелю – аа. Признаки, сцепленные с полом обозначаются в случае Х – сцепленного наследования как Хª или ХА

Пример краткой записи условия и решения задачи

Задача. У человека вариант карего цвета глаз доминирует над вариантом голубого цвета. Голубоглазая женщина выходит замуж за гетерозиготного кареглазого мужчину. Какой цвет глаз может быть у детей?

Краткая запись условия Краткая запись решения

А - карий цвет глаз Родители- Р аа х Аа

А – голубой цвет глаз гаметы - G а А, а

Родители: аа х Аа потомство - F Аа аа

Потомство? карий цвет голубой цвет

Задание 3

Кратко запиши условие генетической ситуационной задачи и ее решение.

Задача: Учеловека близорукость доминирует над нормальным зрением. У близоруких родителей родился ребенок с нормальным зрением. Каков генотип родителей? Какие еще дети могут быть от этого брака?

Практическая работа

Тема: «Решение генетических задач».

Цель: научиться решать генетические задачи; объяснять влияние внешних факторов на проявление признака; использовать навыки генетической терминологии.

Оборудование: учебник, тетрадь, условия задач, ручка.

Ход работы:

1. Вспомнить основные законы наследования признаков.

2. Коллективный разбор задач на моногибридное и дигибридное скрещивание.

3. Самостоятельное решение задач на моногибридное и дигибридное скрещивание, подробно описывая ход решения и сформулировать полный ответ.

4. Коллективное обсуждение решения задач между учащимися и учителем.

5. Сделать вывод.

Задачи на моногибридное скрещивание

Задача № 1. У крупного рогатого скота ген, обусловливающий черную окраску шерсти, доминирует над геном, определяющим красную окраску. Какое потомство можно ожидать от скрещивания гомозиготного черного быка и красной коровы?

Разберем решение этой задачи. Вначале введем обозначения. В генетике для генов приняты буквенные символы: доминантные гены обозначают прописными буквами, рецессивные - строчными. Ген черной окраски доминирует, поэтому его обозначим А. Ген красной окраски шерсти рецессивен - а. Следовательно, генотип черного гомозиготного быка будет АА. Каков же генотип у красной коровы? Она обладает рецессивным признаком, который может проявиться фенотипически только в гомозиготном состоянии (организме). Таким образом, ее генотип аа. Если бы в генотипе коровы был хотя бы один доминантный ген А, то окраска шерсти у нее не была бы красной. Теперь, когда генотипы родительских особей определены, необходимо составить схему теоретического скрещивания

Черный бык образует один тип гамет по исследуемому гену - все половые клетки будут содержать только ген А. Для удобства подсчета выписываем только типы гамет, а не все половые клетки данного животного. У гомозиготной коровы также один тип гамет - а. При слиянии таких гамет между собой образуется один, единственно возможный генотип - Аа, т.е. все потомство будет единообразно и будет нести признак родителя, имеющего доминантный фенотип - черного быка..

Таким образом, можно записать следующий ответ: при скрещивании гомозиготного черного быка и красной коровы в потомстве следует ожидать только черных гетерозиготных телят

Следующие задачи следует решить самостоятельно, подробно описав ход решения и сформулировав полный ответ.

Задача № 2. Какое потомство можно ожидать от скрещивания коровы и быка, гетерозиготных по окраске шерсти?

Задача № 3. У морских свинок вихрастая шерсть определяется доминантным геном, а гладкая - рецессивным.

1. Скрещивание двух вихрастых свинок между собой дало 39 особей с вихрастой шерстью и 11 гладкошерстных животных. Сколько среди особей, имеющих доминантный фенотип, должно оказаться гомозиготных по этому признаку?

2. Морская свинка с вихрастой шерстью при скрещивании с особью, обладающей гладкой шерстью, дала в потомстве 28 вихрастых и 26 гладкошерстных потомков. Определите генотипы родителей и потомков.

Задачи на ди- и полигибридное скрещивание

Задача № 7. Выпишите гаметы организмов со следующими генотипами: ААВВ; aabb; ААЬЬ; ааВВ; АаВВ; Aabb; АаВЬ; ААВВСС; ААЬЬСС; АаВЬСС; АаВЬСс.

Разберем один из примеров. При решении подобных задач необходимо руководствоваться законом чистоты гамет: гамета генетически чиста, так как в нее попадает только один ген из каждой аллельной пары. Возьмем, к примеру, особь с генотипом АаВbСс. Из первой пары генов - пары А - в каждую половую клетку попадает в процессе мейоза либо ген А, либо ген а. В ту же гамету из пары генов В, расположенных в другой хромосоме, поступает ген В или b. Третья пара также в каждую половую клетку поставляет доминантный ген С или его рецессивный аллель - с. Таким образом, гамета может содержать или все доминантные гены - ABC, или же рецессивные - abc, а также их сочетания: АВс, AbC, Abe, аВС, аВс, а bС.

Чтобы не ошибиться в количестве сортов гамет, образуемых организмом с исследуемым генотипом, можно воспользоваться формулой N = 2n, где N - число типов гамет, а n - количество гетерозиготных пар генов. В правильности этой формулы легко убедиться на примерах: гетерозиготаАа имеет одну гетерозиготную пару; следовательно, N = 21 = 2. Она образует два сорта гамет: А и а. ДигетерозиготаАаВЬ содержит две гетерозиготные пары: N = 22 = 4, формируются четыре типа гамет: АВ, Ab, aB, ab. ТригетерозиготаАаВЬСс в соответствии с этим должна образовывать 8 сортов половых клеток N = 23 = 8), они уже выписаны выше.

Задача № 8. У крупного рогатого скота ген комолости доминирует над геном рогатости, а ген черного цвета шерсти - над геном красной окраски. Обе пары генов находятся в разных парах хромосом.

1. Какими окажутся телята, если скрестить гетерозиготных по обеим парам

Признаков быка и корову?

2. Какое потомство следует ожидать от скрещивания черного комолого быка, гетерозиготного по обеим парам признаков, с красной рогатой коровой?

Дополнительные задачи к лабораторной работе

Задача № 1. На звероферме получен приплод в 225 норок. Из них 167 животных имеют коричневый мех и 58 норок голубовато-серой окраски. Определите генотипы исходных форм, если известно, что ген коричневой окраски доминирует над геном, определяющим голубовато-серый цвет шерсти.

Задача № 2. У человека ген карих глаз доминирует над геном, обусловливающим голубые глаза. Голубоглазый мужчина, один из родителей которого имел карие глаза, женился на кареглазой женщине, у которой отец имел карие глаза, а мать - голубые. Какое потомство можно ожидать от этого брака?

Задача № 3. Альбинизм наследуется у человека как рецессивный признак. В семье, где один из супругов альбинос, а другой имеет пигментированные волосы, есть двое детей. Один ребенок альбинос, другой - с окрашенными волосами. Какова вероятность рождения следующего ребенка-альбиноса?

Задача № 4. У собак черный цвет шерсти доминирует над кофейным, а короткая шерсть - над длинной. Обе пары генов находятся в разных хромосомах.

1. Какой процент черных короткошерстных щенков можно ожидать от скрещивания двух особей, гетерозиготных по обоим признакам?

2. Охотник купил черную собаку с короткой шерстью и хочет быть уверен, что она не несет генов длинной шерсти кофейного цвета. Какого партнера по фенотипу и генотипу надо подобрать для скрещивания, чтобы проверить генотип купленной собаки?

Задача № 5. У человека ген карих глаз доминирует над геном, определяющим развитие голубой окраски глаз, а ген, обусловливающий умение лучше владеть правой рукой, преобладает над геном, определяющим развитие леворукости. Обе пары генов расположены в разных хромосомах. Какими могут быть дети, если родители их гетерозиготны?

Задача №6. У человека рецессивный ген а детерминирует врождённую глухонемоту. Наследственно глухонемой мужчина женился на женщине, имеющей нормальный слух. Можно ли определить генотип матери ребёнка?

Задача №7. Из желтого семени гороха получено растение, которое дало 215 семян, из них 165 желтых и 50 зелёных. Каковы генотипы всех форм?

Задача№8. Отец и мать ощущают горький вкус фенилтиомочевины. Двое из четверых детей не чувствуют вкуса этого препарата. Принимая, что различия по чувствительности к фенилтиомочевине моногенны, определите доминантна или рецессивна нечувствительность к фенилтиомочевине.

Окраска по Граму.

1 этап - приготовление мазка.

Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия (ИХН). Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.

2 этап - высушивание.

Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.

3 этап - фиксация.

Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон, смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.

4 этап - окраска.

Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристаллвиолетом (3-5 минут), а сложных - окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.

Дифференцирующий метод Грама

После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+). другие - в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.

Этапы окраски по Грамму