Фосфолипазы, их классификация и свойства. Инозитолтрифосфат и даг тоже являются вторичными мессенджерами Продуктом фосфолипазы c является

Фосфолипаза - фермент, гидролизующий фосфолипиды. Различают 4 основных класса фосфолипаз: A, B, C и D, каждый из которых гидролизует определенную связь в фосфолипиде. Фосфолипазы класса А подразделяются на фосфолипазы A1, отщепляющие SN-1 ацильную цепь фосфолипида и фосфолипазы A2, отщепляющие SN-2 ацильную цепь. Среди фосфолипаз А2 выделяют:

внеклеточные фосфолипазы А2 ядов змей, рептилий и насекомых
панкреатическую фосфолипазу
внутриклеточные фосфолипазы А2

Панкреатическая фосфолипаза

Панкреатическая фосфолипаза - фосфолипаза класса А2 (КФ 3.1.1.4), липолитический фермент , разлагающий жиры пищи (триглицериды). Секретируется в виде профермента поджелудочной железы профосфолипазы, который активируется в тонкой кишке трипсином (Саблин О.А. и др.). Оптимальная кислотность для каталитической активности панкреатической фосфолипазы 7,5–9,0 рН . «Работает» как фермент в присутствии Ca 2+ (являющимся коферментом для фосфолипазы).

При гидролитическом расщеплении лецитина желчи фосфолипазой А образуется лизолецитин . Дальнейший метаболизм лизолецитина катализируется фосфолипазой В, которая тормозится желчными кислотами (Маев И.В. и др.)

Роль фосфолипазы в развитии некоторых форм панкреатита

При недостаточности большого сосочка двенадцатиперстной кишки и повышенном давлении в двенадцатиперстной кишке возможен рефлюкс желчи или дуоденального содержимого в протоки поджелудочной железы. Желчь, попадая в протоки поджелудочной железы, может подвергаться воздействию панкреатической фосфолипазы, уже активированной трипсином, в результате чего образуется лизолецитин, который, проникая в интерстициальное пространство поджелудочной железы, вызывает глубокие повреждения в клетках.

Вы наверное знаете, что нашему организму необходим кислород, чтобы выжить? На самом деле в нем нуждается каждая клетка нашего организма. Клетки используют кислород для производства энергии в виде АТФ, или аденозинтрифосфата, крайне важной молекулы, которую еще называют «энергетической валютой клетки». Клетки используют ее, чтобы, по сути, «заплатить» молекулам за особый вид работ. Этот процесс напоминает большую фабрику, на которой трудятся рабочие, выполняющие различные функции, необходимые для ее успешного функционирования, а в качестве оплаты они получают молекулы АТФ. Таким образом, получается, что митохондрии клеток получают кислород и производят АТФ для оплаты рабочим, используя процесс, который называется окислительное фосфорилирование, а митохондрии являются своего рода «бухгалтерией» фабрики, верно? Когда клетка не получает достаточное количество кислорода, а «бухгалтерия» не выдает АТФ, который должен быть передан рабочим в качестве оплаты за их труд, то вся клеточная фабрика может пострадать. Такой процесс называется гипоксией, где «гипо-» значит «ниже нормы», а «оксия» - «обогащение кислородом». Когда кислород попадет в организм, обычно он сразу оказывается в «бухгалтерии», иными словами, во внутренней мембране митохондрии, где и происходит процесс окислительного фосфорилирования. Кислород используется на одной из последних стадий процесса и выступает в роли акцептора электронов. Это и способствует окончанию процесса производства АТФ. Именно поэтому без кислорода мы не сможем завершить процесс окислительного фосфорилирования и соответственно произвести АТФ. Но почему фабрика разваливается, если «бухгалтерия» перестает производить АТФ? Почему бы ей просто не остановить работу? Сделать передышку? Когда некоторые рабочие перестают выполнять свою работу, все немного выходит из-под контроля. Один из таких суперважных рабочих – это натрий-калиевый насос, который находится в клеточной мембране и выполняет функцию «пробки», регулирующей количество натрия, попадающего в клетку. По сути, он просто каждый раз откачивает излишки натрия, проникающего в клетку, и поддерживает разность концентраций. Этот процесс также предотвращает попадание молекул воды в клетку. Представьте: молекулы воды могут беспрепятственно проникать повсюду. Они постоянно двигаются взад и вперед, но все ионы натрия, находящиеся на одной стороне клетки, физически стремятся предотвратить попадание воды в нее, поэтому с течение времени на одной стороне с натрием скапливается все больше молекул воды, иными словами, они фактически оказываются в ловушке. Таким образом, получается, что чем больше у нас молекул натрия, тем больше скапливается молекул воды. Однако наш насос выполняет эту работу не бесплатно. Ему нужны молекулы АТФ. Без них он перестает откачивать натрий, который в свою очередь начинает проникать в клетку… Он продолжает проникать до тех пор, пока разность концентраций не снижается. Таким образом, при меньшем количестве частиц натрия с внешней стороны, предотвращающих попадание молекул воды в клетку, вода начинает проникать в клетку вслед за натрием, в результате чего клетка набухает. Когда клетка набухает, происходит следующее. Обычно у каждой клеточной мембраны есть маленькие микроворсинки, напоминающие маленькие пальчики, которые увеличивают площадь поверхности клетки и таким образом позволяют клетке всасывать больше веществ. Когда клетка набухает и раздувается, вода наполняет эти маленькие пальчики, что уменьшает площадь поверхности клетки и затрудняет всасывание молекул в связи с уменьшившейся площадью. Клетка может вздуться или деформироваться из-за большого количества воды. Это является признаком того, что цитоскелет клетки начинает разрушаться, а вода начинает просачиваться во что-то типа мягкого пузыря. В конце концов, гранулярный эндоплазматический ретикулум, или гранулярный ЭПР, начинает набухать также, как и сама клетка. На поверхности гранулярного ЭПР находится большое количество рибосом, которые крайне важны для производства белков. Однако, когда гранулярный ЭПР набухает, рибосомы отсоединяются и перестают производить белки, поэтому процесс синтеза белков приостанавливается. Но это не значит, что все молекулы АТФ сразу исчезают. Когда нам не хватает кислорода, а окислительное фосфорилирование прекращается, наши клетки, к счастью, способны найти другой способ, как получать АТФ. Он называется анаэробный гликолиз, где «анаэробный» значит «бескилородный». Это своего рода резервный генератор АТФ, который, конечно, не такой эффективный, но может производить около 2 молекул АТФ на 1 молекулу кислорода, в то время как при процессе окислительного фосфорилирования производятся около 30-36 молекул... Конечно, резервный генератор помогает, но он также производит и побочную молочную кислоту, которая понижает уровень pH в клетке. Более кислотная среда может изменять или разрушать естественные свойства белков и ферментов. Однако, все не так плохо. Существует еще одно суперважное явление, происходящее в клетке. Процессы, в которых она участвует, теоритически обратимы. Это значит, что если наш организм снова станет получать кислород и производить АТФ, то все изменения можно будет повернуть вспять. Хотя необратимый урон клетке все-таки может быть нанесен, но спустя некоторое время. Точно так же, как существует натрий- калиевый насос, есть и кальциевый насос, который помогает предотвратить попадание излишнего количества кальция в клетку. Но если этот процесс останавливается, то кальций начинает накапливаться, а это уже плохо. Сначала кальций активирует определенные ферменты, активацию которых лучше избегать, как, например, протеазы, которые могут расщеплять белки и разрушать цитоскелет клетки, который служит для того, чтобы поддерживать «фабрику», ее структурное строение. Также могут активироваться и эндонуклеазы, которые расщепляют ДНК, генетический материал клеток. Но вернемся к молочной кислоте. Если в клетке ее накапливается большое количество, и среда становится более кислотной, то может быть разрушена лизосомная мембрана, в которой содержатся гидролитические ферменты, служащие для расщепления больших молекул. Когда эти ферменты оказываются вне мембраны, то они также активируются кальцием. В этом случае они начинают расщеплять все, что попадает в их поле зрения, и, по сути, начинают переваривать клетку изнутри.Затем активируется фосфолипаза, которая, по сути, расщепляется фосфолипиды. А так как мембрана сделана из фосфолипидов, то она может быть разрушена, что и станет самым важным признаком необратимого урона. Когда мембрана разрушена, ферменты, которые мы сейчас перечислили, наряду с другими, могут попадать в кровь и наносить серьезный ущерб организму. Но давайте вернемся к кальцию. Как Вы могли заметить, активация ферментов – это не единственное влияние, которое оказывает кальций на клетки. Кальций может проникать в митохондрии, вызывая каскад сигналов, делая мембрану митохондрий более проницаемой для небольших молекул, поэтому молекулы, которые обычно остаются в митохондриальном цитохроме с, просачиваются в цитозоль. Это является верным признаком того, что дела идут плохо. По сути, это своего рода аналог кнопки самоуничтожения, которая запускает процесс, под названием апоптоз, иными словами, это запрограммированная гибель клетки. Что-то типа клеточного суицида. На этом этапе клетка находится не в самом лучшем состоянии, не так ли? В итоге все это случается лишь по причине недостатка кислорода, или гипоксии.

Содержание
Введение
1. Фосфолипазы
1.1Классификация. Свойства
1.2Система фосфолипаза С - инозитол-3-фосфат
2. Фосфолипазы А2
2.1 Общие сведения (реакция,открытие, строение)
2.2 Классификация исвойства
2.2.1 Цитозольные ФЛА2
2.2.2 Секреторные ФЛА2
2.2.3 КальцийнезависимаяФЛА2
2.3 Субстратнаяспецифичность
2.4 Ингибиторы ФЛА2
2.4.1 Неконкурентноеингибирование
2.4.2 Конкурентноеингибирование

2.7 Биологическая рольФЛА2
Списоклитературы

Введение
Фосфолипазы (англ. phospholipase) ферменты класса гидролаз,катализирующие гидролиз фосфоглицеридов… В зависимости от положениягидролизуемой связи в фосфолипиде различают 4 основных класса фосфолипаз: A, B,C и D.
/>
Лизофосфолипиды расщепляются под действием фосфолипаз L (существованиепозиционно специфичных фосфолипаз L1 и L2 не доказано). Фосфолипазы В - устаревшее назв. препаратов, обладающих активностью по типу фосфолипаз А и L.
/>
X - остаток холина, серина, миоинозита и др.; для фосфолипаз L1R2=C(O)R4, R3=H; для фосфолипаз L2 R2=H, R3=C(O)R4
Каждое из семейств фосфолипаз неоднородно и включает ферменты,значительно отличающиеся по молекулярным массам, субъединичному составу идругим свойствам. Все фосфолипазы наиболее активно катализируют гидролиз наповерхности раздела фаз фосфолипид - вода; медленно гидролизуют водорастворимыесубстраты.
Фосфолипаза A1 - (КФ 3.1.1.32, англ. phospholipase A1) отщепляет SN-1 ацильную цепь.
Фосфолипаза A2 - (КФ 3.1.1.4, англ. phospholipase A2) отщепляет SN-2 ацильнуюцепь.
Фосфолипаза B-(лизофосфолипаза, англ. phospholipase B) отщепляет обе SN-1 и SN-2 ацильныецепи. Фосфолипаза, обладающая активностями как фосфолипазы А1 так и А2, то естьспособной гидролизовать ацильную цепь фосфолипида в sn-1 и sn-2 положениях.
Фосфолипаза C - (КФ 3.1.4.3, англ. phospholipase C) гидролизует связь между глицериновымостатком фосфолипида и полярной фосфатной группой, при этом образуютсядиацилглицерин и фосфат-содержащая полярная группа.
Фосфолипаза D - (КФ 3.1.4.4, англ. phospholipase D) гидролизует связь между фоасфатнойгруппой и спиртовой группой, при этом высвобождаются фосфатидная кислота испирт. Существует 2 изоформы этой фосфолипазы D1 и D2.
Фосфолипазы играют важную роль в обмене липидов в живыхорганизмах. Их используют для определения структуры фосфоглицеридов и места ихлокализации в мембранах.

1. Фосфолипазы.
1.1 Классификация. Свойства
Фактически различают несколько фосфолипаз группы А, они являютсясоставной частью многих тканей и секретов живых организмов.
Фосфолипазы A1в большинстве своем - внутриклеточные ферменты, часто мембраносвязанные, ненуждаются в коферменте. Их молекулярные массы варьируют в пределах 15-90 тыс.;оптимальная каталитическая активность проявляется при рН 4,0 (для лизосомальныхферментов) или 8,0-9,5 (для ферментов микросом, плазматических мембран ицитозоля); широко распространены в животных тканях (печень, сердце, мозг) и вмикроорганизмах (Bacillus subtilis, В. megateiium, Mycobacter phlei,Escherichia coli).
Фосфолипазы А1 отщепляют ацильную цепь фосфолипида в sn-1положении. При действии фосфолипазы А1 на фосфолипид образуется1-лизофосфолипид и жирная кислота. Фосфолипаза является активным компонентомзмеиного яда гемолитического действия.
Фосфолипазы A2 - наиболее изученные представители фосфолипаз. Известны 3 группы фосфолипаз A2:1) ферменты ядов змей, рептилий и насекомых, существующие в виде большогоколичества изоформ; 2) ферменты поджелудочной железы млекопитающих,продуцирующиеся в организме в виде зимогенов (предшественников с большеймолекулярной массой) и активирующиеся трипсином; 3) внутриклеточные ферменты изкрови и тканей животных, среди которых имеются как растворимые, так имембраносвязанные.
Фосфолипазы A2 первых двух подгрупп являются водорастворимымиферментами с молеклярной масссой 11-19 тыс. (некоторые активны в виде димеров),обладают высокой стабильностью благодаря большому числу (6-7) дисульфидныхсвязей. Оптимальная каталитическая активность при рН 7,5-9,0; рI от 4,0 до10,5; кофермент - Ca2+. Для множества представителей этих подгрупп фосфолипазизвестны первичная и пространственная структур. В активном центре обнаруженыостатки гистидина и аспарагиновой кислоты. Свойства внутриклеточных фосфолипазA2 (третья подгруппа) зависят от субклеточной локализации фермента. Ихмолекулярная масса 12-75 тыс.; оптимальная каталитическая активность при рН 4,2-9,0.Некоторые ферменты этой подгруппы не содержат коферментов.
Фосфолипазы Ввыделены из растений, микроорганизмов, яда пчел, тканей млекопитающих. Ферментыэтой группы крайне неспецифичны, катализируют гидролиз различных сложноэфирныхсвязей, обладают литическим (разрушающим) действием по отношению к биологическимембранам (что обусловливает их токсичность). Молекулярная масса фосфолипаз В15-65 тыс., они менее стабильны, чем фосфолипазы А; их оптимальнаякаталитическая активность проявляется при рН от 4,5 (лизосомальный фермент) до10,0 (ферменты ядов). Фосфолипазы не имеют коферментов, не ингибируютсяэтилендиаминтетрауксусной кислотой. Некоторые фосфолипазы В ингибируютсядиизопропилфторфосфатом и п-хлормеркурбензойной кислотой. Универсальные ингибиторыдля всех фосфолипаз В - ПАВ.
Фосфолипаза В способна гидролизовать ацильную цепь фосфолипида вsn-1 и sn-2 положениях Как правило фосфолипаза действует на лизолецитин(лизофосфатидилхолин), образующийся в результате действия фосфолипазы А1 налецитин (фосфатидилхолин).
Фосфолипазы Собнаружены у бактерий Clostridium, Bacillus и Pseudomonas, а также в клеткахмлекопитающих (печень, мозг, поджелудочная железа). Для некоторых из ниххарактерна строгая специфичность по отношению к спиртовой группе молекулы субстрата,например к остатку холина (фосфолипазы Cx) и миоинозита (фосфолипазы Си).Молекулярная масса фосфолипаз С от 23 до 51 тыс. Ионы Zn2+ являются для нихкоферментом и стабилизатором. Оптимальная каталитическая активность при рНоколо 7 для фосфолипаз Cx, и при рН
Фосфолипаза С, гидролизующая фосфодиэфирную связь междуглицериновым остатком фосфолипида и полярной фосфатной группой, относится кфосфодиэстеразам также как и фосфолипаза D. Фосфолипаза С является ключевымферментом метаболизма фосфатидилинозитола и липидных сигнальных путей.
Фосфолипаза С активируется Gαq или Gβγсубъединицами G-белка. Таким образом, она является частью G-белоксвязанногорецептора (англ. G protein-coupled receptor) и соответствующего сигнального путиили частью трансмембранного рецептора с внутренней или ассоциированнойтирозинкиназной активностью.
Фосфолипаза С гидролизует фосфатидилинозитол (PIP2) на двавторичных медиатора инозитолтрифосфат (IP3) и диацилглицерин (DAG). Этимедиаторы становятся вовлечены в последующие этапы сигнальных путей. Вчастности, они модулируют кальциевые каналы эндоплазматического ретикулума ипротеинкиназу С, соответственно.
Фосфолипаза Dотносится к группе важных ферментов, которые в живых системах выполняютразнообразные функции от усвоения питательных веществ до синтеза биологическиактивных соединений. Обнаружены в растениях (овощи, водоросли), микроорганизмахи в тканях животных. Их молекулярная масса 90-116 тыс. Оптимальнаякаталитическая активность при рН 4,7-8,0. Катионные ПАВ ингибируют фосфолипазыD, анионные - активируют.
Фосфолипаза D проявляет прежде всего гидролитическую активность, врезультате которой происходит расщепление сложноэфирной связи между остаткомфосфатидной кислоты и спирта в молекулах фосфолипидов (ФЛ). При этом последнийзамещается на водород, но возможен перенос остатка фосфатидной кислоты на самыеразные гидроксилсодержащие акцепторы, что представляет большой интерес длябиотехнологии, так как трансфосфатидилирующая активность фосфолипазы может бытьиспользована для синтеза разнообразных лекарственных препаратов.
Фосфолипаза D специфически расщепляет фосфатидилхолин нафосфатидную кислоту и холин, высвобождая последний в цитоплазму.
/>/>/>
фосфатидилхолин фосфатидная кислота холин
1.2 Система фосфолипаза С - инозитол-3-фосфат
Активация мембранной гуанилатциклазы происходит не поднепосредственным влиянием гормон-рецепторного комплекса, а опосредованно черезионизированный кальций и ок-сидантные системы мембран. Определяющая эффектыацетилхолина стимуляция активности гуанилатциклазы также осуществляетсяопосредованно через Са2+. Через активацию гуанилатциклазы реализует эффект ина-трийуретический гормон предсердий - атриопептид. Путем активациипе-рекисного окисления стимулирует гуанилатциклазу гормон эндотелия сосудистойстенки оксид азота - расслабляющий эндотелиальный фактор. Под влияниемгуанилатциклазы из ГТФ синтезируется цГМФ, активирующий цГМФ-зависимыепротеинкиназы, которые уменьшают скорость фосфорилирования легких цепей миозинав гладких мышцах стенок сосудов, приводя к их расслаблению.
В большинстве тканей биохимические и физиологические эффекты цАМФи цГМФ противоположны. Примерами могут служить стимуляция сокращений сердца подвлиянием цАМФ и торможение их цГМФ, стимуляция сокращения гладких мышцкишечника цГМФ и подавление цАМФ. цГМФ обеспечивает гиперполяризацию рецепторовсетчатки глаза под влиянием фотонов света. Ферментативный гидролиз цГМФ, аследовательно, и прекращение гормонального эффекта, осуществляется с помощьюспецифической фосфодиэстеразы.
/>
Опосредование гормонального сигнала системой фосфолипаза С-инозитол-3-фосфат.
Образование гормон-рецепторного комплекса при участиирегуляторного G-белка активирует мембранную фосфолипазу С, вызывающую гидролизфосфолипидов мембраны с образованием двух вторичных посредников:инозитол-3-фосфата и диацилглицерола. Инозитол-3-фосфат ведет к выходу Са2+ извнутриклеточных депо. Связывание ионизированного кальция со специализированнымбелком кальмодулином активирует протеинкиназы и вызывает фосфорили-рованиевнутриклеточных структурных белков и ферментов. Диацилглицерол повышаетсродство протеинкиназы С к Са2+, способствуя ее активации, что такжезавершается процессами фосфорилирования белков. Диацилглицерол одновременнореализует другой путь опосредования гормонального эффекта, активируяфосфолипазу А2 и образование простаноидов.
Гормонрецепторный комплекс с участием регуляторного G-белка ведетк активации мембранного фермента фосфолипазы С, вызывающей гидролиз фосфолипидовмембраны с образованием двух вторичных посредников: инозитол-3-фосфата идиацилглицерола. Инозитол-3-фосфат вызывает выход Са2+ из внутриклеточных депо,в основном из эндоплазматического ретикулума, ионизированный кальцийсвязывается со специализированным белком кальмодулином, что обеспечивает активациюпротеинкиназ и фосфорилирование внутриклеточных структурных белков и ферментов.В свою очередь диацилглицерол способствует резкому повышению сродствапротеинкиназы С к ионизированному кальцию, последний без участия кальмоду-линаее активирует, что также завершается процессами фосфорилирования белков.
Диацилглицерол одновременно реализует и другой путь опосредованиягормонального эффекта за счет активирования фосфолипазы А2. Под влияниемпоследней из мембранных фосфолипидов образуется арахидоновая кислота,являющаяся источником мощных по метаболическим и физиологическим эффектамвеществ - простагландинов и лейкотриенов. В разных клетках организма превалируетодин или другой путь образования вторичных посредников, что в конечном счете иопределяет физиологический эффект гормона. Через рассмотренную системувторичных посредников реализуются эффекты адреналина (при связи сальфа-адренорецептором), вазопрессина (при связи с V-1-рецептором),ангиотензина-И, соматостатина, окситоцина.

2. Фосфолипазы А2
2.1 Общие сведения (реакция, открытие,строение)
Фосфолипаза А2 (К.Ф.3.1.1.4.) – фермент, катализирующий отщеплениеостатка жирной кислоты - лецитин, кефалин - от фосфолипидов, превращая их втоксичные соединения, сильно уменьшающие поверхностное натяжение. Этисоединения растворяют эритроциты и другие, клеточные и субклеточные структуры ипоэтому его называют лизолецитинами и лизокефалинами
В молекуле фосфолипидов фосфолипаза пчелиного яда отщепляет жирнуюкислоту со второго места в молекуле и поэтому ее называют фосфолипазой А2. Онаизвестна с 1897 года (Лангер) как фактор, усиливающий гемолитическую активностьпчелиного яда после добавления лецитина. Фосфолипаза является наиболееисследованным энзимом пчелиного яда. Как пищеварительный фермент фосфолипазабыла открыта в 1900 году. Сейчас очевидно, что фосфолипаза А2 (ФЛА2) – большечем пищеварительный фермент. Она широко распространена и присутствует в большинствеклеток и тканей млекопитающих, выполняя функции регулятора метаболизма,поддержания мембранного гомеостаза, образования предшественников эйкозаноидов.
В зависимости от молекулярной массы, клеточной локализации иприсутствия ионов Са2+ различают цитозольные ФЛА2, секреторные и Са-независимыеФЛА2 или ФЛА2 внешней мембраны.
ФЛА2 включают несколько не связанных белковых семейств с общейферментативной активностью. Два наиболее важных семейства - это секретируемые ицитозольные фосфолипазы А2.
Цитозольные ФЛА2:
Внутриклеточные фосфолипазы, также как и внеклеточные, относятся ккальций-зависимым ферментам. Структурно, однако, они сильно отличаются отсекретируемых фосфолипаз. Как правило, они значительно крупнее (более 700аминокислот) и содержат C2 домен, который направляет фермент к клеточноймембране. Эти фосфолипазы в основном участвуют в клеточных сигнальных путях,таких как воспалительная реакция. Под действием ФЛА2в клетке можетобразовываться арахидоновая кислота, предшественник эйкозаноидов, такихактивных сигнальных молекул как лейкотриены и простагландины.
ФЛА2 внешней мембраны:
Грам-отрицательные бактерии содержат на внешней мембране ФЛА2 сшироким спектром специфичности. В кишечной палочке (Escherichia coli) этотфермент участвует в выбросе токсина бактериоцина из клетки за счёт повышеннойпроницаемости мембраны при увеличении уровня лизофосфолипидов и жирных кислот вмембране.
Секретируемые ФЛА2:
Экстраклеточные формы фосфолипаз были выделены из различных ядовзмей, пчёл и ос. Они также находятся во всех тканях млекопитающих и вбактериях. Активность этих фосфолипаз требует наличия кальция.
/>
Фосфолипаза А2 пчелиного яда во внеклеточном пространстве вблизилипидного бислоя. Полярные группы фосфолипидов находятся между жёлтой и краснойплосткостями. Неполярные ацильные цепи - между красной и чёрной плоскостями.
Панкреатическая фосфолипаза относится к ферментам пищеварения иучаствует в переваривании липидов пищи. Фосфолипазы яда участвуют вобездвиживании жертвы за счёт лизиса её клеток.
2.2 Классификация и свойства
2.2.1 Цитозольные ФЛА2
История цитозольных фосфолипаз группы А2 началась в 1991 г., когдаиз цитозоля различных клеток животных был выделен и клонирован белокмолекулярной массой 85 кДа, который кроме молекулярной массы отличался отизвестных к тому времени фосфолипаз отсутствием дисульфидных мостиков ичувствительностью к кальцию. Позже скрининг нуклеотидных баз позволил найти ещёдва паралога – cPLA2b и cPLA2g. Первый из найденных белков получил названиеcPLA2a. Называясь «цитозольным», фермент действует тем не менее на мембранахцитоплазматического ретикулума и ядра. Эта изоформа ФЛА2 присутствует во многихклетках и тканях: мозге, почках, селезенке, легких, макрофагах, нейтрофилах,альвеолярных эпителиальных клетках и др. Фермент становится активным врезультате фосфорилирования митоген-активируемыми протеинкиназами ипротеинкиназой С. Различные внеклеточные цитокины, митогены, гормоны,нейромедиаторы, факторы роста, антигены, эндотоксины, а так же определенныефизические и стрессовые воздействия, включая ультрафиолетовый свет иоксидативный стресс, индуцируют активацию и синтез цитозольной ФЛА2.
Основной особенностью этого изотипа фермента является то, что оннаиболее активно гидролизует фосфолипидные субстраты, содержащие во второмположении арахидоновую кислоту. Такая субстратная селективность и определяетосновную функцию фермента в клетке.
Методом ядерного магнитного резонанса была охарактеризованапространственная структура этого фермента; несколько позже появилисьрентгеноструктурные данные. Фермент гидролизует сложноэфирную связь в положенииsn-2. Для проявления максимальной ферментативной активности требуютсясравнительно низкие концентрации ионов Ca2+ (порядка 500 нмоль/л); причёмприсутствие ионов Ca2+ необходимо не для проявления ферментативной активности,а для связывания белка с поверхностью внутриклеточных мембран или в случаемодельных систем – с липидными частицами. Фермент практически не различаетгруппы в положении sn-1, но обладает специфичностью к фосфолипидам, содержащимарахидоновую кислоту в положении sn-2. Олеиновая (18: 1) и линолевая (18: 2)кислоты под действием cPLA2a слабо отщепляются от соответствующих фосфолипидов,но a-линолевая (18: 3) и эйкозапентаеновая (20: 5) кислоты имеют преимуществаперед арахидоновой кислотой. Поскольку указанные кислоты находятся в клетках вкрайне низких концентрациях, то фосфолипиды с арахидоновой кислотой в положенииsn-2 становятся основным субстратом. Фермент не проявляет специфичности кзаместителю в положении sn-3, но тем не менее диацилглицерин не является егосубстратом. Помимо основной активности фермент проявляет и лизофосфолипазнуюактивность, т. е. способен отщеплять ацил из положения sn-1 лизофосфолипида.Предполагают, что эта активность нужна для защиты клетки от повышеннойконцентрации лизофосфолипидов, при которой могут нарушаться функции мембран.Показано, что фермент может также проявлять трансацилазную активность.Биологическое значение этой активности изучается.
Паралоги цитозольной ФЛА2 описаны совсем недавно и сведения об ихсвойствах ограничены. Известно, что белок cPLA2g не содержиткальцийсвязывающего домена и не зависит от ионов Ca2+; имеет всего 29 %сходства с аминокислотной последовательностью белка cPLA2a. Он связан смембраной за счёт пальмитинового сайта и проявляет в основном изофосфолипазнуюактивность. Показано его участие в развитии апоптоза макрофагов. Белок cPLA2bимеет кальцийсвязывающий домен, но также проявляет преимущественно свойстваФЛА1, т.е. гидролизует связь sn-1.
Фермент cPLA2a – единственная на сегодняшний момент фосфолипаза,которая специфична к арахидоновой кислоте и предпочитает субстраты,локализованные в мембране, а не находящиеся в мономерной форме в растворе.Возможно, эти свойства можно объяснить существованием амфифильной «крышки»(аминокислотные остатки 413-457), которая предотвращает вход жирнокислотногоостатка фосфолипида в туннель активного центра в случае, если белок нелокализован на мембранах. «Крышка» открывается при взаимодействии белка санионными липидами мембраны. Межфазный катализ, осуществляемый этим ферментом,интенсивно изучается.
Открытие цитозольной ФЛА2 в конце 1980-х гг. дало толчок кизучению регуляции синтеза эйкозаноидов в организме при остром ответе наразличные провоспалительные стимулы. Регуляция секреторной фосфолипазыпроисходит на уровне её экспрессии, а активность цитозольной фосфолипазы вклетке регулируется также на уровне активности фермента. Основными факторами,влияющими на активность цитозольной фосфолипазы являются концентрациявнутриклеточного Са2+ и фосфорилирование этого фермента протеинкиназами.Концентрация ионов Са2+ и активность различных протеинкиназ в клетке являютсявесьма лабильными параметрами, изменяющимися в течение нескольких секунд послесвязывания лигандов - агонистов с соответствующими клеточными рецепторами, чтопозволяет эффективно регулировать в клетке продукцию арахидоновой кислоты исоответственно синтез эйкозаноидов.
В неактивированных клетках концентрация внутриклеточного Са2+обычно колеблется в пределах 30-100 нмоль/л. При активации различных рецепторовконцентрация ионов Са2+ может достигать 1-3 мкмоль/л. В ряде работ былопоказано, что увеличение активности цитозольной ФЛА2 происходит в диапазонеконцентраций ионов Са2+ 150-800 нмоль/л. При увеличении концентрации ионов Са2+происходит миграция фосфолипазы к мембранам и её прикрепление к ним, после чегоначинается гидролиз фосфолипидов.
Связывание фосфолипазы с мембраной происходит за счёт имеющегося вбелке домена С2:
/>
Домен С2 гомологичен подобным доменам протеинкиназы С, ГТФазы, ифосфолипазы С. Все эти белки связываются с мембранами в присутствии ионов Са2+.Наличие достаточных концентраций ионов Са2+ необходимо для ориентациифосфолипазы и её прикрепления. В отсутствие ионов Са2+ фермент сохраняетактивность по отношению к растворимым субстратам, таким как1-пальмитил-2-лизофосфатидилхолин.
В зависимости от типа агониста концентрация ионов Са2+ в клеткеменяется по-разному. Одни агонисты вызывают её кратковременный рост внутриклетки; под действием этих агонистов концентрация ионов Са2+ после резкогоподъёма возвращается к исходному уровню в течение 1-2 мин. Другие же вызываютпродолжительный рост концентрации ионов Са2+, и повышенная концентрация ионовСа2+ сохраняется в клетке от 5-30 мин. На эпителиальных клетках было показано,что для устойчивого прикрепления ФЛА2 к поверхности биологических мембраннеобходима повышенная концентрация ионов Са2+ в течение 5 мин, а прикратковременном подъёме через 1-2 мин происходит обратная диссоциация белка вцитозоль без заметного высвобождения арахидоновой кислоты. Если же повышеннаяконцентрация ионов Са2+ сохраняется в течение 5 мин и более, то цитозольнаяфосфолипаза ФЛА2 остаётся на мембране и гидролиз фосфолипидов продолжается дажепосле возврата концентрации внутриклеточного Са2+ к нормальным значениям.
Для проявления максимальной активности фосфолипазы прикратковременном увеличении концентрации ионов Са2+ внутри клетки необходимотакже фосфорилирование белка киназами. В опытах in vitro было показано, чтоцитозольная фосфолипаза может быть фосфорилирована протеинкиназой С,митогенактивируемыми протеинкиназами р42/р44 или протеинкиназой А, но толькофосфорилирование митогенактивируемыми протеинкиназами (MAPK) приводит кзначительному увеличению активности фосфолипазы. Митогенактивируемыепротеинкиназы фосфорилируют фосфолипазу по остатку Ser-505. В ряде случаевименно фосфорилирование определяет проявление активности фосфолипазы в клетке.
Таким образом, цитозольная фосфолипаза принимает участие как врегуляции синтеза эйкозаноидов при остром ответе клеток на различныепровоспалительные стимулы, так и в ряде случаев при отложенном ответе.Основными факторами, регулирующими активность цитозольной фосфолипазы, являютсяконцентрация внутриклеточного Са2+ и активность митогенактивируемыхпротеинкиназ. Активность фермента может значительно возрастать в течение первыхминут после стимуляции клеток. Транслокация фермента при активации важна подвум причинам: 1) позволяет ферменту взаимодействовать с фосфолипидамимембраны; 2) доставляет селективную по арахидоновой кислоте липазу к местурасположения ферментов синтеза простагландинов (PG) и лейкотриенов (LT), т. е.потенциально возможно образование компартмента, в котором высвобождаемаяарахидоновая кислота непосредственно метаболизируется далее.
2.2.1 Секреторные ФЛА2
Секреторные ФЛА2 имеют молекулярную массу около 14 кДа,характеризуются абсолютной необходимостью ионов Са2+ в миллимолярныхконцентрациях для каталитической активности, рН оптимум находится в интервале7-9.
В настоящее время описано десять типов секреторной ФЛА2 (IВ, IIА,IIC, IID, IIE,IIF,III,V, X,XII) которые различаются первичной структурой ирасположением дисульфидных мостиков. Все типы секреторных фосфолипазпредставляют собой глобулярные белки, богатые цистеином (5-8 дисульфидныхмостиков), что обеспечивает стабильность фермента, в том числе устойчивость кпротеолизу и денатурации. Фермент не проявляет избирательности в отношениижирнокислотного состава фосфолипидов, но предпочтительно гидролизуетотрицательно заряженные фосфолипиды (фосфатидную кислоту и фосфатидилглицерол).
Долгое время была известна только одна ФЛА2, которая в изобилииприсутствует в панкреатической жидкости (тип IB). В 1989 г. была открыта иклонирована фосфолипаза типа IIA, которая хранится в секреторных гранулахтромбоцитов и концентрация которой значительно увеличивается в местахвоспаления, таких как синовиальная жидкость при ревматоидном артрите. Эти белкиимеют большое сходство с белками яда змей. Среди белков ядов пчёл и ящериц былиобнаружены другие фосфолипазы, которые отнесены к типу III. У млекопитающихбелок, соответствующий этому типу, был обнаружен только в 2000 г… Новый периодв исследованиях секреторных фосфолипаз начался в 1994 г., когда были открытыбелки типа IIC и V. Это открытие привело к пересмотру роли этого семействабелков в регуляции функций клеток и интенсивному поиску новых аналогичныхбелков. Были открыты белки типа X, IID, IIE и IIF, XII.
Все эти белки (кроме белка типа III) имеют молекулярную массу14-17 кДа, содержат гистидин в каталитическом центре и проявляют фосфолипазнуюктивность в присутствии миллимолярных концентраций кальция. Они имеютвысококонсервативные аминокислотные последовательности в каталитическом участке(DXCCXXHD) и участке кальцийсвязывающей петли (XCGXGG), а также 6-8консервативных сульфидных мостиков. В активном центре находится также аспартат,который совместно с кальцийсвязывающей петлей выполняет роль кармана для ионаCa2+.
Ферменты этого семейства не проявляют специфичности ни поотношению к группе, связанной с остатком фосфатидной кислоты, ни по отношению кацильной группе в положении sn-2. Наличие в фосфолипидах окисленных форм жирныхкислот увеличивает активность секреторных фосфолипаз, что предполагает ихучастие в регуляции вязкости мембран при окислительном стрессе. Из данныхрентгеноструктурного анализа первых двух групп белков следует существованиегидрофобного канала, в который входит молекула фосфолипида после межфазногосвязывания белка на фосфолипидной поверхности.
Секреторная ФЛА2 конститутивно содержится в различных клетках,участвующих в развитии иммунных и воспалительных ответов: макрофагах, тучныхклетках, фибробластах и тканях таких органов, как печень, селезенка, тимус,костный мозг, кишечник. Активность фермента на уровне клеток регулируется засчет его индукции различными воспалительными стимулами (интерлейкин-1 иинтерлейкин-6, фактор некроза опухоли, липополисахарид, интерферон-g, форболовыеэфиры, фактор роста нервов). В соответствии с индукцией разнообразнымистимуляторами промотер гена IIA содержит нуклеотидные последовательности TATA иCAAT, а также последовательности связывания таких факторов транскрипции, какAP-1, C/EBP, CREB, NF-kB, STAT, PPA Rg. В некоторых клетках экспрессия ФЛА2зависит от предварительной активации цитозольной фосфолипазы PLА2a, при этомпредполагается вовлечение в процесс регуляции фосфолипазы IIA продуктов 12/15-липоксигеназного пути. Глюкокортикоиды (стероидные противовоспалительныепрепараты) являются супрессорами экспрессии фосфолипазы IIA.
Изменение экспрессии фосфолипазы IIA во многих случаях связано смодуляцией простагландиновой ветви каскада арахидоновой кислоты. Так, пристимуляции интерлейкином-1 и фактором некроза опухоли активировался как синтези секреция фосфолипазы, так и синтез простагландина Е2 и простациклина вмезангиальных или эндотелиальных клетках, соответственно. При добавлении кклеткам антител к фосфолипазе синтез простациклина частично подавлялся. Изрезультатов, полученных в последние годы, следует, что секреторные фосфолипазы(IIA и схожие с ней V, X) участвуют в процессах как быстрой, так и замедленнойпродукции арахидоновой кислоты и простаноидов.
Следует отметить, что добавление секреторных фосфолипаз вовнеклеточную среду приводит к активному высвобождению арахидоновой кислоты исинтезу простаноидов активированными клетками, но практически не влияет нагидролиз фосфолипидов мембран покоящихся клеток.
Помимо роли фермента, ответственного за наличие арахидоновойкислоты, секреторные фосфолипазы могут выступать в роли физиологически активныхвеществ. Так, в тучных клетках специфические ингибиторы секреторных фосфолипазуменьшали стимулированную фактором роста нервов экспрессию циклооксигеназы-2.При этом каталитически неактивные мутанты белка фосфолипазы также были способнывызывать экспрессию циклооксигеназы-2, т.е. этот эффект не зависит от ферментативныхсвойств фосфолипазы. Механизм этого процесса не ясен. Возможно, вовлекаютсяфункции секреторной ФЛА2 как лиганда специфических рецепторов.
Действительно, в 1995 г. было показано, что существуютспецифические белки, которые связываются с фосфолипазой типа IB (константадиссоциации образовавшегося комплекса 1 нмоль/л) и проявляют различныебиологические эффекты. За последующие 10 лет обнаружено ещё много белков,растворимых и мембраносвязанных, которые способны связывать секреторнуюфосфолипазу. Однако свойства «классического» рецептора, который при связываниилиганда активирует систему внутриклеточной передачи сигнала, проявляет толькоодин из этих белков. Это белок M-типа, или sPLA2R. Ген данного белкалокализован во второй хромосоме; белковая последовательность имеет 75 %гомологии среди ряда видов млекопитающих; ген имеет 1 копию и ничем не похож надругие гены. Белок имеет молекулярную массу 180-200 кДа, значительная его частьрасположена во внеклеточной области, в цитозоле находится последовательность из40 аминокислотных остатков. Белок без этого цитозольного участка встречается врастворимой форме и показана его роль как ингибитора эффектов секреторныхфосфолипаз. У человека белок экспрессирован в поджелудочной железе, лёгких ипочках. Показана важная роль активации этого рецептора в развитииэндотоксического шока.
На рисунке представлена схема участия рецептора секреторнойфосфолипазы в реализации биологической роли фермента на уровне клеток.
/>
На схеме показано, как активные формы фосфолипазы sPLA2-IB илиsPLA2–X проявляют свою ферментативную активность, что приводит к появлениюлипидных медиаторов, а также являются высокоаффинными лигандами для рецептора,локализованного в плазматической мембране. Взаимодействие фосфолипазы срецептором мембраны приводит к индукции митогенактивированных протеинкиназ(MAPK) и соответствующего пути внутриклеточного проведения сигнала, чтостимулирует различные ответы клеток: пролиферацию и миграцию клеток, синтез имифизиологически активных веществ. При потере контакта с мембраной рецепторсохраняет возможность связывать фосфолипазу, что позволяет регулироватьактивность последней как фермента и как лиганда.
Таким образом, секреторные фосфолипазы играют существенную роль вразвитии и распространении воспалительных процессов в организме. Экспрессиясекреторных фосфолипаз значительно увеличивается при разнообразныхвоспалительных заболеваниях. По этой причине разрабатывают селективные ингибиторыферментативной активности белков этого семейства как потенциально новый класспротивовоспалительных веществ. Для поиска ингибиторов секреторных фосфолипазперспективно применение методов компьютерного моделирования, так как этинизкомолекулярные белки (их молекулярная масса около 14 кДа) получены вкристаллическом состоянии, известны их трёхмерные структуры. Есть основанияполагать, что в ближайшие 5-10 лет на основании результатов этих исследованийбудут созданы новые терапевтические технологии и новые лекарственные средства.
2.2.3 Кальцийнезависимая ФЛА2
Классическая кальцийнезависимая ФЛА2 (iPLA2-VIA) существует волигомерной форме и имеет несколько сплайс-вариантов, из которых, по крайнеймере, два (VIA-1 и VIA-2) обладают ферментативной активностью. БелокiPLA2-VIA-1 имеет молекулярную массу 85 кДа; содержит 8 анкириновых повторов вобласти N-конца, каталитический домен с характерной аминокислотнойпоследовательностью GXSXG, где S – серин-465 действует как центр катализа.Имеется также ATP-связывающая последовательность GXGXXG. Около С-конца (вобласти аминокислотных остатков 694-705) существует связывающая область длякалмодулина. Образование комплекса белка iPLA2-VIA с активированнымкалмодулином (т. е. в присутствии ионов Ca2+) приводит к инактивации даннойфосфолипазы. Хотя обе сплайс-формы VIA-1 и VIA-2 имеют ATP- связывающиепоследовательности, показано, что только белкок iPLA2-VIA-2, но не iPLA2-VIA-1,активируется в несколько раз в присутствии ATP.
Анкириновые повторы встречаются у нескольких сотен белков, такихкак факторы транскрипции, регуляторы клеточного цикла. Считается, что данныймотив участвует в белок- белковых взаимодействиях. Предполагают, что в клеткахбелок iPLA2-VIA присутствует в виде тетрамера и, возможно, анкириновые мотивы участвуютв олигомеризации белка. Фосфолипаза iPLA2-VIA не специфична к природе жирныхкислот в положении sn-2 и заместителю в положении sn-3 фосфолипида; полностьюактивна в отсутствие кальция и осуществляет межфазный катализ. Фермент такжепроявляет лизофосфолипазную активность по положению sn-1, трансацилазнуюактивность и активность, характерную для белка PAF-AH.
Белок iPLA2-VIB содержит липазный мотив GVSTG, где серин-483находится в каталитическом центре; ATP-связывающий мотив; мотив сигналалокализации в пероксисомах на С- конце молекулы. С-концы молекул, включаяATP-связывающий повтор и каталитический участок, белков iPLA2-VIB и iPLA2-VIAсходны. Отличия наблюдаются в N-конце белка, где у белка iPLA2- VIB нетанкириновых мотивов, много сериновых и треониновых остатков, часть которыхможет фосфорилироваться протеинкиназами А и С. Также имеются пять участковSer-Pro, которые являются мишенями для пролиновых киназ. Одна из этихпоследовательностей (PTSP, остатки 269-272) является сайтом фосфорилирования митогенактивированнымипротеинкиназами. От ионов кальция активность данной изоформы не зависит.Наличие различных участков фосфорилирования у белков группы iPLA2-VI указывает,что роль белков iPLA2-VIA и iPLA2-VIB в клетках может отличаться. Обе кальцийнезависимыефосфолипазы (iPLA2-VIA и iPLA2-VIB) являются мембраносвязанными белками.
2.3 Субстратная специфичность
Катализ код действием ФЛА2 характеризуется поверхностной,позиционной и стерической специфичностью фермента. Фосфолипаза катализируетреакцию на поверхности раздела липид/вода. С одной стороны, для большинствалиполитичсскнх ферментов, включая и ФЛА2, активность фермента оказываетсязначительно выше при существовании субстратов в формеагрегатов (мицелл, смешанных мицелл, монослоев и бислоев), чем при действии наводорастворимые субстраты в мономолекулярной форме.
С другой стороны - ФЛА2 не действует на липидные молекулы всоставе плотно упакованных и, следовательно, труднодоступных липидныхагрегатов. Для создания поверхности раздела фаз в этих случаях обычноиспользуют детергенты (тритон х-100, дезоксихолат натрия). Доказано, что дляоптимального проявления поверхностной специфичности фермента необходимо наличиеагрегированных субстратов с определенной длиной ацильной цепи.
С обнаружением стерической и позиционной специфичности ФЛА2, былисформулированы довольно строгие минимальные требования фермента к субстрату: вположении sn-2 глицеринового остатка липид должен содержать сложноэфирную группу,а в положении sn-з - фосфатную. Позднее было показано, что остаток фосфорной кислотыможет быть замещен сульфониевым: сульфолипид оказался хорошим субстратом ФЛА2,соответствующие фосфолппиды, где связь С-О-Р замещена на связь С-Р, такжегидролизуются ферментом, но в меньшей степени. Поэтому минимальные требованияфермента к субстрату в настоящее время сводят к тому, чтобы глицерофосфолипидобладал природной L-конфигурацией и имел сложноэфирную связь в sn-2-положении глицерина, а также содержал на расстоянии пяти-шести атомовот карбоксильного углерода группу с сильными анионными свойствами. Считается,что фосфатная группа должна иметь одну свободную кислотную функцию.
В фосфолипиде с двумя чувствительными сложиоэфирными связями - дифосфатидилглицерине(кардиолипинс) - гидролизоваться могут обе. Было установлено, что β-лецитины (1, 3-диацил-sn-глпцеро-2-фосфохолиньг) гидролизуются ФЛА2изяда змеиCrotalusadaincniteus, хотя и со сравнительно низкой скоростью.ФЛА2 не гидролизует амидную связь сфинголипидов. Тиоловые аналогифосфатидилхолинов являются хорошими субстратами, что позволяет следить запроцессом гидролиза спектрофотометрически. Де Хаас и др. установили, чтоотрицательный заряд на фосфатной группе не является абсолютным требованием ксубстрату.
Благодаря стерической и позиционной специфичности, ФЛА2 - ценныйинструмент в химии и биохимии липидов. Их используют для установленияпозиционного распределения жирных кислот при анализе фосфоглицеридов, дляразделения рацемических смесей липидов, а также в синтезе липидов для полученияфосфоглицеридов со смешанным составом жирных кислот.
Субстратная специфичность клеточных ФЛА2 до сих пор еще полностьюне очерчена, однако накоплены данные относительно строения субстратов для ФЛА2клеток крови и иммунной системы, в частности, доказана специфичность этихферментов к фосфатидилхолинам, содержащим в sn-2-положенииглицерина арахидонат.
2.4 Ингибиторы ФЛА2
2.4.1 Неконкурентныеингибиторы
Снижение каталитической активности ФЛА2 может происходитьвследствие нарушения равновесия на одной или на нескольких стадиях ферментативнойреакции, поэтому известные ингибиторы этого фермента можно условно разделитьследующим образом.
а) Связывание ингибитором фермента (Е) может сдвигать равновесие Е↔Е*влево и понижать концентрацию каталитически активного Е*. Это происходит при добавлениик везикулам субстрата везикул негидролизуемого аналога субстрата, с которымфермент связывается, но не может быстро десорбироваться. Необходимость наличияионов кальция при связывании ФЛА2 с межфазной поверхностью дает основанияотносить к числу ингибиторов хелатирующие агенты, например EDTA.
б) Липофилъные соединения изменяют фазовые свойства субстратов иуменьшают плотность заряда на межфазной поверхности, сдвигая равновесие Е↔Е*влево. Было показано, что такие изменения вызывают органические растворители,детергенты, спирты, а также катионные амфифилы, фенотиазины и местныеанестетики различной химической природы. Другие ингибиторы - жирные кислоты,мепакрин, аристолоховая кислота - также влияют на стадию связывания-десорбции Е↔Е*,не затрагивая каталитического действия фермента на межфазной поверхности.
в) Некоторые типы неспецифического ингибирования. При определенныхусловиях скорость гидролиза под действием ФЛА2 фосфолипидов, подвергшихсяперекисному окислению, значительно увеличивается. Поэтому антиоксидантысчитаются потенциально способными понижать активность фермента. Белки типалипокортина и калпактина солюбилизируют фосфолипиды межфазной поверхности, темсамым снижая активность ФЛА2. Водорастворимые анионы, такие как гепарин,ингибируют связывание ФЛА2с межфазной поверхностью путемблокирования анионного участка связывания фермента.
г) Ковалентные модификации аминокислотных остатков ФЛА2. 1-Бромоктан-2-он и n-бромфенацилбромид ковалентно связываютсяс His-48 в каталитическом центре фермента иполностью угнетают каталитическую активность; скорость такой модификациизначительно снижается, когда фермент уже связан с межфазной поверхностью.Диальдегиды, подобные госсиполу, модифицируют аминогруппы остатков лизина ФЛА2,ответственные за ее межфазное связывание; скорость модификацииувеличивается в случае уже связанного с межфазной поверхностью фермента.Подобным образом действуют нестероидный терпеноид маноалид, выделенный изморской губки и его синтетический аналог маноалог.
д) Другие соединения. Предположительно, многие другие соединения,в том числе некоторые лекарства, подавляют активность ФЛА2 in vivo, однако,механизм их ингибиторного действия еще не выяснен. Среди таких веществ - биофлавоноиды и ретиноиды, гидроксиэйкозатетраеновые кислоты, фенофетол(агонист [β-адренэргических рецепторов), габексатмезилат, нисерголин,папаверин, циннаризин и амперон.

2.4.2 Конкурентные ингибиторы
Конкурентные ингибиторы ФЛА2 - это аналоги субстратов, продуктовреакции или комплекса переходного состояния. Они конкурируют с субстратом засвязывание с активным центром молекулы Е*, эффективно понижая концентрациюкомплекса ES*. Этот механизм ингибирования былэкспериментально подтвержден при изучении катализа фосфолипидов под действием ФЛА2по типу «scooting».
Общепринятая стратегия создания ингибиторов состоит в заменечувствительной к ФЛА2 сложноэфирной связи на негидролизуемую группу. При этомингибитор должен оставаться близким структурным аналогом субстрата и невызывать изменений в липидных мембранах. В настоящий момент не представляетсявозможным сопоставить имеющиеся данные о конкурентных ингибиторах, посколькуеще не выработано единой теории и количественного описания липолиза на границераздела фаз липид/вода.
Аминоацильные фосфолипиды. Среди фосфатидилхолиновс модификацией.sn-2-сложноэфирной связи был открыт класс мощных конкурентныхингибиторов ФЛА2 - sn-2-амидных аналогов. Замена sn -2-сложноэфирной связи напростую эфирную связь или на углеводородный остаток также приводила кингибированию ФЛА2 по конкурентному типу, но в меньшей степени.
Влияние аминоацильных аналогов фосфолипидов на ферментативнуюактивность ФЛА2, исследовалось, в основном, в модельных экспериментах сосмешанными мицеллами при соблюдении следующих условий:
1)общая концентрация липидов (ингибитора и субстрата) [I] + [S] должна быть постоянной для расчета мольнойдоли ингибитора, α = [I]/([I] + [S]);
2)молекулы субстрата и ингибитора должны занимать одинаковуюплощадь на межфазной поверхности;
3)межфазная поверхность мицелл должна быть достаточно большой,чтобы фермент находился только в связанной форме.
Для оценки воздействия ингибитора на активность ФЛА2 былаиспользована условная величина ингибиторной силы (Z), котораяявляется мерой соотношения констант межфазной диссоциации для субстрата иингибитора и определяется выражением:

Rv= I + αZ,
где Rv - отношениескорости реакции при К≠Кm к скорости реакции при Кi= Кm, α - мольная доля ингибитора в мицелле.
Изучалитакже ингибиторное действие (R)-1- алкил-2-ациламино-1,2-дидезоксиглицеро-З-фосфохолиновыханалогов на панкреатические фосфолипазы млекопитающих. Среди ингибиторов снасыщенными жирнокислотными цепями наибольшую активность имели аналоги с С10-ацильнымицепями. Поведение ненасыщенных аналогов было более сложным как в цвиттерионных,так и в анионных ингибиторах, увеличение числа цис-двойных связей при их определенном расположении вацильной цепи приводило к возрастанию параметра Z .
В ходе исследований стиоамидными аналогами субстратов выяснилось,что тиоамидный аналог фосфатидилэтаноламина с lС50=4.5 * 10-7М является самым сильным из известных ингибиторов ФЛА2.
Исследования, проведенные с аминоацильными ингибиторами, выявилинекоторые аспекты взаимодействия фермент/липид:
1) Введение амидного остатка в sn-2-положение фосфолипидазначительно увеличивает его связывание с каталитическим центром ФЛА2: более нуклеофильныйатом кислорода амидной группы способен сильнее взаимодействовать с электрофиломэтого центра (предположительно, Са2+). Амидная группа предоставляетлучшие возможности и для водородного связывания.
2) α-Метиленовая группа ацильного остатка sn-2-положениифосфолипида отвечает за связывание фосфолипида с каталитическим центромфермента.
3) Увеличение гидрофобности функциональной группы sn-1-положениифосфолипида повышает сродство между ферментом и субстратом.
4) Фосфатидилэтаноламииы оказались более сильными ингибиторами,чем фосфатидилхолины.
Подход к синтезу оптически активных 1-ацил-2-ациламино-2-дезоксиглицерофосфохолинов основывается на сохранении хиральностиисходного соединения (L-серина) на протяжении всего синтеза.Выбранная последовательность введения заместителей предполагает использованиеминимального числа защитных групп. Также разработан стереоспецифический методсинтеза 1-алкил-2-ациламино-2-дезоксиглицерофосфохолинов исходя из L-серина. Введение алифатической алкильной группы осуществляютвзаимодействием метансульфоната жирной кислоты с оксазолинзащищеннымдезоксиглицеридом. Рацемические длинноцепочечные ациламиноаналоги фосфолипидовпредложено получать исходя из 2-аминопропанола. Описан синтез оптическиактивного тиоамидного аналога фосфатидилхолина.
Фтаркетоновыеаналоги. Ранее установлено, что аналоги субстратов, содержащиеполяризованные кетоновые группы, включая фторкетоновые и 1,2-дикетоновые,ингибируют гидролитические ферменты. Наилучшим ингибитором оказался замещенныйфосфоэтаноламин с единственным ацильным остатком, несмотря на то, что ферментпредпочитает субстраты с двумя ацильными остатками
Так какдифторкетоновая группа легко гидратируется в водном растворе, ингибиторынапоминают по структуре тетраэдрический интермедиат, который образуется вовремя липолиза.
Средифторкетоновых аналогов были найдены селективные ингибиторы внутриклеточныхцитозольных ФЛА2. Такими ингибиторами оказались электрофильные кетоновыеаналоги арахидоновой кислоты.
Самыммощным ингибитором оказался, α-трифторметилкетон арахидоновой кислоты. Методами l9F- и 13С-ЯМР-спектроскопии анализировали строениекомплекса этого вещества с ФЛА2. Результаты подтвердили гипотезу о том, что присвязывании с активным центром фермента образует полукеталь с остатком серинаили треонина молекулы белка, благодаря способности α-фторкетонов легкогидратироваться в водных растворах.
Фосфатные аналоги. Для изученияприроды ингибирования ФЛА2 из различных источников и влияния заместителей наингибиторную способность было синтезировано более 100 sn-2-фосфатных аналоговфосфатидилхолинов. Соединения данного класса ингибировали только фермент, ужесвязанный с межфазной поверхностью и не оказывали влияния на десорбциюфермента. Фосфатные ингибиторы связываются с активным центром фермента черезион кальция координационной связью Е-Са… О=Р, конкурируя с субстратами. Этовзаимодействие модулируется заместителями молекулы ингибитора. Замещение в этомкомплексе атома О на S, NН2, группы 0=Р на О=С-О,присутствие отрицательно заряженной фосфатной группы значительно понижалосродство к ферменту. Ингибиторная способность фосфоэфиров находилась в строгойзависимости от стереохимических и структурных особенностей: хиральности sn-2-положения, длины алкильной цепи вsn-положении и присутствия гидрофобного заместителя в sn -3-положении глицерина. Сульфонатные, амидные, оксимсодер жащие,дианионные фосфомоноэфирные аналоги не проявляли ингибиторных свойств.
Алкильные фосфотидилхолины. Для фармакологического использования, по-видимому, наиболееперспективными являются вещества, способные ингибировать ФЛА2 без нарушенияструктурной организации мембраны. Особый интерес в этом плане представляют липидыс простой эфирной связью. В молекулах липидов данного класса гидрофобныезаместители присоединены к гидрофильному остатку за счет негидролизуемой ФЛА2простой эфирной связи. Вместе с тем, по своему поведению в составе мембранлипиды с простой эфирной связью практически не отличаются от своих диацильныханалогов. Изучали влияние длинноцепочечных фосфатидилхолинов с простой эфирнойсвязью на разрушение мембран под действием ФЛА2 методом спектроскопии ""Р-ЯМР иоценивали возможность применения липидов при местных воспалительных реакциях.
Для исследуемых ингибиторов были получены практически одинаковыерезультаты: введение соединений в состав липидного бислоя из яичногофосфатидилхолина в мольном соотношении 1: 1 приводило к настолько эффективнойстабилизации мембран, что не наблюдалось никаких структурных перестроек поддействием этого фермента.
Среди фосфолипидов данного класса были найдены ингибиторыцитозольных ФЛА2:, обладающие противовоспалительными и антиаллергическимисвойствами.

2.5 Значение для организмапри нарушении активности
Впатогенезе повреждения клетки важное значение имеет чрезмерная активация ФЛА2. Освободившиеся под действием фосфолипазы,ненасыщенные жирные кислоты (арахидоновая, пентаноевая и др.) расходуются наобразование физиологически активных соединений - простагландинов илейкотриенов. Оставшаяся часть молекулы фосфолипида (лизофосфолипид) имеет лишьодин жирнокислотный «хвост», вследствие чего обладает способностью кмицеллообразованию и является очень сильным детергентом. С детергентнымдействием лизофосфолипидов и связано повреждение клеточных мембран в условияхчрезмерной активации ФЛА2.
Фармакологические и токсические свойства фосфолипазы обусловленыее биохимической активностью. С помощью своего токсического лизолецитина, онарасщепляет кровяные и тканевые структуры, повреждая их клеточные мембраны иорганеллы. Фосфолипаза снижает свертывание крови, разрушая способствующиесвертыванию компоненты, в структуре которых имеются фосфолипиды. Она повреждаетмембраны митохондрий, а последние являются важным органоидом клетки, носителямисложных ферментных систем. Они участвуют в обмене веществ иокислительно-восстановительных процессах. Повреждение фосфолипидной структурынервных волокон, вероятно, обусловлено фосфолипазой, которая блокируетпроводимость между нервной и мышечной тканью.
Введение фосфолипазы под кожу вызывает местное воспаление, авнутривенное сопровождается снижением кровяного давления у подопытных животных,отеком легких, кровоизлияниями в альвеолах. У переживших несколько часовживотных, в моче обнаруживается гемоглобин разрушенных эритроцитов. Кроме того,установлено, что фосфолипаза пчелиного яда, введенная под кожу, усиливаетразвитие модельных воспалительных процессов различной этиологии.
Высказывается предположение, что своим снижающим поверхностноенатяжение действием мелиттин подготавливает фосфолипиды к энзимной активностифосфолипазы. Из всех составных частей пчелиного яда фосфолипаза являетсянаиболее сильным антигенным и аллергенным раздражителем. В крови иммунных кпчелиному яду пчеловодов имеются антитела с высоким титром против яда.Сверхчувствительные к пчелиному яду пациенты при лабораторных исследованиях нааллергичность остро реагировали на фосфолипазу.
Усиливающие воспалительные процессы токсические и аллергическиесвойства фосфолипазы характеризуют ее как вредную для организма человекасоставную часть пчелиного яда.
Активация ФЛА2 зависит от кальция. Она происходит при стимуляцииклеток надпочечников, что приводит к ускорению кругооборота арахидонилфосфатидилинозитола.Этот эффект вызывается также кальциевым ионофором и может отражать повышениевнутриклеточного уровня кальция и вторичной стимуляцией ФЛА2 в качестве раннейреакции, сопутствующей рецепторному взаимодействию. Известно, что действие настероидогенез в надпочечниках зависит от кальция, а не только от образованияцАМФ. По крайней мере, часть потребностей в кальции может быть связана сопосредуемым ФЛA2 кругооборотом мембранных фосфолипидов при активации корынадпочечников.
Механизм, включающий активацию фосфолипазы, может отражать общеесвойство гормонрегулируемых секреторных клеток, при гормональной стимуляцииспецифических клеток мишеней меняются и другие этапы метаболизма фосфолипидов.Так, в клетках гранулемы яичника, где ЛГ увеличивает продукцию простагландинов,гормон не повышает образование арахидоновой кислоты, а действует на болеепоздних этапах, увеличивая активность простагландинсинтетазы. Этот эффект ЛГ насинтез простагландинов в граафовом фолликуле (пузырчатый яичниковый фолликул),по-видимому, не опосредует стероидогенного действия гонадотропина, но играетважную роль в развитии овуляции.
2.6 Использование ФЛА2 вмедицине
Секреторную ФЛА2 рассматривают как один из патогенетическихфакторов формирования ряда заболеваний: ревматоидного артрита, атеросклероза. Впоследние годы появились сведения о причастности этого фермента к патологиилегких. Особый интерес представляет патогенетическая цепь «сФЛА2 –острыйреспираторный дистресс синдром (ОРДС) – сурфактант легких».
Острый респираторный дистресс синдром взрослых возникает врезультате как прямых воздействий на легкие (аспирация, ингаляция токсическихвеществ,100% кислород, недостаточно квалифицированное проведение ИВЛ), так инепрямых (сепсис, шок любой этиологии, политравма, кровопотеря). Несмотря нагоды интенсивных исследований, механизм развития ОРДС остается до конца неясен, а смертность от него высокой (~50%). Считают, что в основе происхожденияэтого состояния легких лежит снижение продукции и активности сурфактанта.
Сурфактант легких – липогликопротеиновый комплекс, которыйсинтезируется альвеолоцитами II типа. Он состоит на 80-90% из фосфолипидов,5-10% нейтральных липидов и 5-10% белков. Кроме поверхностно-активных свойств,необходимых для нормального дыхания, он обладает противовоспалительным ииммунорегуляторным действием. Нарушение его целостности приводит к увеличениюсил поверхностного натяжения не только в альвеолах, но и в бронхиолах и мелкихбронхах.
Субстратная специфичность цитозольной ФЛА2 к арахидоноил-содержащимсубстратам предполагает, что именно эта изоформа играет основную роль впатогенезе астмы. Известно, что лейкотриены В4, С4, D4, E4 – основная группамедиаторов, вовлеченная в комплексный воспалительный процесс и приводящая кклиническим проявлениям астмы. Действие лейкотриенов заключается в сокращениигладкой бронхиальной мускулатуры, увеличении количества вырабатываемой слизи,стимулировании сосудистой проницаемости и образовании отека. Все эти признакисвойственны астме. Лейкотриены синтезируются в ответ на воздействие аллергенаили неспецифической реакции, приводящей к активации цФЛА2.
Chilton F. H. изучали присутствие продуктов фосфолипазнойактивности в бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных астмой спустя 5-30мин, 6, 20 ч. после антигенной провокации. Концентрация лизопродуктов была в 7раз выше по сравнению с контрольной группой. Отсюда было сделано предположениео том, что гидролиз фосфолипидов сурфактанта приводит к генерациицитотоксичного лизофосфатидилхолина, который может оказывать прямоедетергентное действие на мембрану и влиять на активность мембранных каналов ибелков. Кроме того, трансформируясь в фактор активации тромбоцитов, он вызываетнарушение проницаемости альвеолярно-капиллярного барьера, бронхоспазм,агрегацию тромбоцитов.
Предполагается также участие цФЛА2 в возникновении и развитиилегочного фиброза – малопонятного, на сегодняшний день, интерстициальногопоражения паренхимы легких. Патогенез этого состояния включает чрезмернуюпродукцию провоспалительных медиаторов, воспаление альвеол, пролиферациюфибробластов и накопление коллагена. Классической экспериментальной модельюэтого состояния является фиброз легких, вызванный внутритрахеальным иливнутрибрюшинным введением блеомицина.
Велика роль фосфолипазы в развитии некоторых форм панкреатита.
При недостаточности большого сосочка двенадцатиперстной кишки иповышенном давлении в двенадцатитперстной кишке возможен рефлюкс желчи илидуоденального содержимого в протоки поджелудочной железы. Желчь, попадая впротоки поджелудочной железы, может подвергаться воздействию панкреатическойфосфолипазы, уже активированной трипсином, в результате чего образуетсялизолецитин, который, проникая в интерстициальное пространство поджелудочнойжелезы, вызывает глубокие повреждения в клетках.
Также доктором Heidi May быладоказана, что липопротеин-ассоциированной ФЛА2 предсказывает риск коронарной смерти.
Полученные в последние годы сведения о причастности цитозольной исекреторной ФЛА2 к формированию патологии легких открывают перспективу поискановых подходов к лечению таких заболеваний. Однако прежде необходимо четкоопределить место этих ферментов в патогенетической цепи молекулярных событий. Издесь важное значение может принадлежать «синдромальному » подходу. Кпримеру, еще нет сведений о состоянии ФЛА2 при гипертермии и гипоксии, приактивации клеток продуцентов. Между тем, большинству заболеваний легких присущиэти состояния, которые во многом определяют клиническую картину, течение иисход патологического процесса.
2.7 Биологическая роль ФЛА2
Кнастоящему времени достаточно полно охарактеризованы и изучены секретируемыеФЛА2 ядов и панкреатических желез млекопитающих. Напротив, относительно низкиеконцентрацииin vivo внутриклеточных инепанкреатических внешнеклеточных ФЛА2, серьезно осложняют исследования этогокласса ферментов.
Установлено,что мембраносвязанные ФЛА2 играют важную роль в регуляторных процессахклеточного метаболизма. Известно несколько путей регуляции этих ферментов,однако общий механизм очень сложен и до конца не изучен. ФЛА2 участвует впередаче через мембраны химических сигналов в ответ на внешнее воздействие.Фермент эффективно гидролизует фосфолипиды, имеющие в своем составе пероксидыжирных кислот, восстанавливая структурно-функциональные свойства клеточныхмембран. По-видимому, изменение молекулярной конформации окисленных липидов облегчаетдоступ фермента к sn-2-сложноэфирной связи.
Насегодняшний день установлено, что фосфолипазы А2 играют значительнуюроль в развитии воспалительного процесса. Вклад фермента заключается в запускесинтеза липидных регуляторов этой реакции - одной из групп так называемыххимических медиаторов воспаления. Они образуются, активируются или мобилизуютсяв воспалительном очаге и их соотношением определяется характер течения патологическогопроцесса. Медиаторы воспаления липидной природы представлены жирными кислотамии их производными (простагландинами, лейкотриенами, тромбоксанами), а такжефосфолипидным фактором активации тромбоцитов (ФАТ). Полагают, что ввоспалительном процессе участвуют внутриклеточные цитозольные ФЛА2, высвобождающиеполиеновые кислоты из sn-2-положения глицеринового остатка мембранных фосфолипидов.Полиеновые жирные кислоты, включая и арахидоновую, обладают собственнойбиологической активностью, в т.ч. усиливают сосудистую проницаемость, вызываютагрегацию тромбоцитов, оказывают вазоактивное действие.
Другиепродукты фосфолипазной реакции гидролиза - лизофосфолипиды, обладающие ярковыраженной цитотоксичностью и детергентными свойствами. Эти соединения обнаруживаютпри таких заболеваниях, как холецистит, инфаркт миокарда, катаракта, псориаз идр. Если жирная кислота высвобождается из фосфатидилхолина 1-О-алкилыюго типа,образующийся лизофосфолипид служит предшественником ФАТ - медиатора воспаления,аллергической реакции, септического шока и астматического состояния. Этосоединение в настоящее время интенсивно изучается, агонистам и антагонистам ФАТпосвящено большое число публикаций.
Важноезначение, которое имеет мембраносвязанная ФЛА2 в клеточной регуляции, а такжеее повышенный уровень при ряде патологических процессов, приводят кнеобходимости регулирования активности этого фермента. Поэтому поиск новыхклассов липидных ингибиторов и разработка удобных методов их синтезапредставляют в настоящее время практический интерес.

Список литературы
1. Брагина Н.А., Чупин В.В., Булгаков В.Г. Липидные ингибиторы фосфолипазы А2, М., 1999, с. 83-96
2. Брокерхоф X., ДженсенР., Липолитические ферменты, пер. с англ., M., 1978, с. 242-356

фосфоглицеридов. В зависимости от места действия на субстрат (позиционной специфичности) различают фосфолипазы A 1 , A 2 , Си D(хим. связи, к-рые гидролизуют эти Ф., показаны на ф-ле I); лизофосфолипиды расщепляются под действием Ф. L(ф-ла II; существование позиционно специфичных Ф. L 1 и L 2 не доказано). Ф. В - устаревшее назв. препаратов, обладающих активностью по типу Ф. А и L.

X - остаток холина, серина, мио -инозита и др.; для Ф. L 1 R 2 =C(O)R 4 , R 3 =H; для Ф. L 2 R 2 =H, R 3 =C(O)R 4

Каждое из семейств Ф. неоднородно и включает ферменты, значительно отличающиеся по мол. массам, субъединичному составу и др. св-вам. Все Ф. наиб. активно катализируют гидролиз на пов-сти раздела фаз фосфолипид - ; медленно гидролизуют водорастворимые субстраты.

Ф. A 1 в большинстве своем - внутриклеточные ферменты, часто мембраносвязанные, не нуждаются в коферменте. Их мол. массы варьируют в пределах 15-90 тыс.; оптимальная каталитич. проявляется при рН 4,0 (для лизосо-мальных ферментов) или 8,0-9,5 (для ферментов микросом, плазматич. мембран и цитозоля); широко распространены в животных тканях (печень, сердце, мозг) и в микроорганизмах (Bacillus subtilis, В. megateiium, Mycobacter phlei, Escherichia coli).

Ф. A 2 - наиб, изученные представители Ф. Известны 3 группы Ф. A 2: 1) ферменты ядов змей, рептилий и насекомых, существующие в виде большого кол-ва изоформ (см. Изофер-менты) 2) ферменты поджелудочной железы млекопитающих, продуцирующиеся в организме в виде зимогенов (предшественников с большей мол. массой) и активирующиеся трипсином; 3) внутриклеточные ферменты из крови и тканей животных, среди к-рых имеются как р-римые, так и мембра-носвязанные. Ф. 2 > первых двух подгрупп являются водорастворимыми ферментами с мол. м. 11-19 тыс. (нек-рые активны в виде димеров), обладают высокой стабильностью благодаря большому числу (6-7) дисульфидных связей; оптимальная каталитич. активность при рН 7,5-9,0; рI от 4,0 до 10,5; кофермент - Ca 2+ . Для мн. представителей этих подгрупп Ф. известны первичная и пространственная структура; в активном центре обнаружены остатки гистидина и аспара-гиновой к-ты. Cв-ва внутриклеточных Ф. A 2 (третья подгруппа) зависят от субклеточной локализации фермента. Их мол. м. 12-75 тыс.; оптимальная каталитич. активность при рН 4,2-9,0; нек-рые ферменты этой подгруппы не содержат коферментов.

Ф. L выделены из растений, микроорганизмов, яда пчел, тканей млекопитающих. Ферменты этой группы крайне неспецифичны, катализируют гидролиз разл. сложноэфирных связей, обладают литическим (разрушающим) действием по отношению к биол. мембранам (что обусловливает их ). Мол. м. Ф. L 15-65 тыс., они менее стабильны, чем Ф. А; их оптимальная каталитич. активность проявляется при рН от 4,5 (лизосомальный фермент) до 10,0 (ферменты ядов); Ф. Lне имеют коферментов, не ингибируются этилендиамин-тетрауксусной к-той; нек-рые Ф. Lингибируются диизопро-пилфторфосфатом и п-хлормеркурбензойной к-той; универсальные для всех Ф. L - ПАВ.

Ф. Собнаружены у бактерий Clostridium, Bacillus и Pseudo-monas, а также в клетках млекопитающих (печень, мозг, поджелудочная железа). Для нек-рых из них характерна строгая специфичность по отношению к спиртовой группе молекулы субстрата, напр. к остатку холина (Ф. C x) и мио -инозита (Ф. С и). Мол. м. Ф. С от 23 до 51 тыс., Zn 2+ являются для них коферментом и стабилизатором; оптимальная каталитич. активность при рН ок. 7 для Ф. C x и при рН < 7 для Ф. С и.

Ф. Dобнаружены в растениях (овощи, водоросли), микроорганизмах и в тканях животных. Их мол. м. 90-116 тыс.; оптимальная каталитич. активность при рН 4,7-8,0. Катион-ные ПАВ ингибируют Ф . D , анионные - активируют.

Помимо гидролитич. ф-ции Ф. обладают трансацилазной (Ф. A 1 , A 2 и L) и транс фосфатидилазной (Ф. Си D) активностью.

Ф. играют важную роль в обмене липидов в живых организмах. Их используют для определения структуры фосфо-глицеридов и места их локализации в мембранах.

Лит.: Брокерхоф X., Дженсен Р., Липолитические ферменты, пер. с англ., M., 1978, с. 242-356; Van den Bosch H., "Biochim. et Biophys. Acta", 1980, v. 604, № 2, p. 191-246; Dennis E. А., в кн.: The enzymes, 3 ed., v. 16, N. Y.- L., 1983, p. 307-53. T. В. Романова.

Химическая энциклопедия. - М.: Советская энциклопедия . Под ред. И. Л. Кнунянца . 1988 .

Смотреть что такое "ФОСФОЛИПАЗЫ" в других словарях:

Ферменты класса гидролаз; катализируют гидролиз фосфоглицеридов. В зависимости от места действия на фосфоглицерид различают Ф. А, В, С и D. Ф. А отщепляет остаток жирной к ты в положении 2 (образующийся при этом токсич. лизофосфатид гидролизуется … Биологический энциклопедический словарь

Фосфолипаза (англ. phospholipase) фермент, который гидролизует фосфолипиды. В зависимости от положения гидролизуемой связи в фосфолипиде различают 4 основных класса фосфолипаз: A, B, C и D. Классификация Схема фосфолипида и положения эфирных… … Википедия

- (син. лецитиназы) ферменты класса гидролаз (КФ 3.1.4.3. и 3.1.4.4), катализирующие расщепление сложноэфирных связей в фосфолипидах … Большой медицинский словарь

Фосфолипаза А2 пчелиного яда во внеклеточном пространстве вблизи липидного бислоя. Полярные группы фосфолипидов находятся между жёлтой и красной плосткостями. Неполярные ацильные цепи между красной и чёрной плоскостями … Википедия

В работе изучено состояние процессов перекисного окисления липидов и содержание фосфолипазы А2 в периферической крови беременных III триместра с обострением герпес-вирусной инфекции в зависимости от титра антител IgG к вирусу простого герпеса 1 типа. Установлено, что обострение герпес-вирусной инфекции в период гестации способствует активации процессов перекисного окисления липидов, регистрируемого по содержанию ТБК-активных продуктов (малонового диальдегида), повышению содержания фосфолипазы А2, наиболее выраженное при титре антител IgG к ВПГ-1 1:12800 и является причиной деструктивных процессов в составе липидов эритроцитов.

беременность

герпес-вирусная инфекция

фосфолипаза А2

перекисное окисление липидов

1. Братусь В.В., Талаева Т.В. Воспаление и проатерогенные нарушения обмена липопротеинов: взаимосвязь и причинно-следственная зависимость (обзор литературы) // Украинский ревматологический журнал. – 2002. – Т. 7, № 1. – С. 13–22.

2. Владимиров Ю.А, Арчаков Р.М. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. – М.: Наука, 1972. – 252 с.

3. Гаврилов В.Г., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой // Вопросы медицинской химии. – 1987. – № 1. – С. 118–121.

4. Дорофиенко Н.Н., Ишутина Н.А. Изменения липидного спектра сыворотки крови у женщин во время беременности при поражении организма герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. – 2008. – Вып. 28. – С. 25–28.

5. Дурасова Н.А. Беременность и герпес-вирусная инфекция // Справочник фельдшера и акушерки. – 2010. – № 8. – С. 24–29.

6. Фетоплацентарная система при герпесной инфекции / М.Т. Луценко, И.А. Довжикова, А.С. Соловьева [и др.]. – Благовещенск, 2003. – 200 с.

7. Изменения липидного обмена у беременных с гестозом / О.В. Поршина, А.Н. Кильдюшов, Л.В. Ледяйкина [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. – 2009. – Т. 16, № 1. – С. 103–105.

8. Влияние липидов ЛПНП на активность секреторной фосфолипазы А2 группы IIА / Е.В. Самойлова, А.А. Пиркова, Н.В. Проказова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – Т. 150, № 7. – С. 45–47.

9. Титов В.Н.Диагностическое значение определения содержания фосфолипазы А2 в липопротеинах плазмы крови и функциональные связи с С-реактивным белком // Клиническая лабораторная диагностика. – 2010. – № 8. – С. 3–16.

10. Анализ спектра фосфолипидов и активности фосфолипазы А2 тромбоцитов у беременных с поздним токсикозом, больных гипертонической болезнью / М.М. Шехтман, Ю.Г. Расуль-Заде, К.М. Хайдарова [и др.] // Акушерство и гинекология. – 1997. – № 4. – С. 15–17.

Многочисленные исследования последних лет свидетельствуют о возрастающем значении герпес-вирусных заболеваний в развитии акушерской патологии. Преимущественное значение отводится вирусу простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирусу и их способности инфицировать плод . Важную роль в патогенезе герпес-вирусной инфекции (ГВИ) играет интенсификация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) . ПОЛ, являясь одним из важных биологических процессов в организме, позволяет выявить возможный переход обратимых изменений в необратимые . Дестабилизация биологических процессов при ГВИ происходит при накоплении в организме вторичных продуктов ПОЛ , обладающих токсическим действием, основным из которых является малоновый диальдегид (МДА) , по содержанию данного метаболита в плазме судят о выраженности ПОЛ в организме, особенно при возникновении в нем деструктивных процессов, определяя, таким образом, степень выраженности патологических реакций .

Под действием конечных продуктов ПОЛ активируется фермент фосфолипаза А2, субстратом для которой являются фосфолипиды клеточных мембран, после гидролиза и отщепления от фосфолипидов свободных жирных кислот образуются медиаторы широкого спектра клеточных процессов провоспалительного характера. В итоге образование продуктов гидролиза фосфолипидов с участием фосфолипазы А2 способствует тканевому воспалению и нарушению гемостаза .

В доступной литературе мы не нашли данных об исследовании фосфолипазы А2 у беременных с ГВИ. Поэтому цель исследования состояла в изучении активности фосфолипазы А2 в периферической крови беременных III триметра с обострением ГВИ в зависимости от активности процессов ПОЛ и титра антител IgG к ВПГ-1.

Материал и методы исследования

В основу работы положены клинико-лабораторные результаты исследований 60 беременных с обострением ГВИ в III триместре гестации. В зависимости от титра антител IgG к ВПГ-1 беременные были разделены на две группы. Первую группу составили 30 женщин с титром антител IgG к ВПГ-1 1:3200, вторую - с титром антител IgG к ВПГ-1 1:12800. В качестве группы контроля обследованы 30 практически здоровых беременных на том же сроке.

Активность секретируемой фосфолипазы А2 в периферической крови беременных определяли иммуноферментным методом анализа с помощью наборов реактивов фирмы «Cayman chemical» (США). Об интенсивности процессов ПОЛ судили по накоплению ТБК-активных продуктов (МДА), концентрацию которого определяли общепринятым методом с применением тиобарбитуровой кислоты по методу В.Б. Гаврилова и соавт. .

Титр антител к ВПГ-1 определяли по динамике антител IgG с помощью стандартных тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) на микропланшетном ридере «Stat-Fax 2100» (USA). Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденные Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 226. Все участники исследований подписывали протоколы добровольного информированного согласия.

Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью «Автоматизированной системы диспансеризации» (правообладатель ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН, 2005 г, версия 2.5). Проверку нормальности распределения проводили по критерию Колмагорова-Смирнова. Анализируемые в статье данные имели нормальное распределение. Поэтому проводился расчет средней арифметической (М) и ошибки средней арифметической (m). Проверку гипотезы о статистической значимости различных двух выборок проводили с помощью критерия t-Стьюдента и считали значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ полученных результатов исследования показал, что при обострении ГВИ в период гестации в периферической крови беременных с титром антител IgG к ВПГ-1 1:3200, отмечалась незначительная интенсификация ПОЛ, о чем свидетельствовало недостоверное увеличение содержания ТБК-активных продуктов (МДА), по сравнению с аналогичными показателями группы контроля (таблица).

Примечание. p - уровень значимости различий между показателями с контрольной группой.

У беременных второй группы (титр антител IgG к ВПГ-1 1:12800) содержание ТБК-активных продуктов (МДА) в периферической крови превышало физиологический допустимый уровень на 34 % (p < 0,001), по сравнению с контролем (см. таблицу).

Следует отметить, что особое место среди ферментов, участвующих в липидном обмене занимает фосфолипаза А2. За счет роста активности данного фермента происходит снижение уровня ненасыщенных жирных кислот в условиях повышенного образования их из фосфолипидов. Исследование содержания фосфолипазы А2 в периферической крови беременных III триместра с обострением ГВИ показало, что при титре антител IgG к ВПГ-1 1:12800, на фоне увеличения содержания ТБК-активных продуктов (МДА) (см. таблицу) и снижения количества антиоксиданта α-токоферола , концентрация данного соединения увеличивалась на 56 %, по сравнению с контролем (см. таблицу). При титре антител IgG к ВПГ-1 1:3200 в периферической крови беременных статистически значимых изменений в содержании данного энзима установлено не было (табл.). Продукты гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А2 (лизофосфатидилхолин и арахидоновая кислота) могут участвовать напрямую или опосредовано в синтезе значительного числа различных биологически активных веществ провоспалительного характера - простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов . Лизофосфатидилхолин обладает свойствами хемоаттрактанта для циркулирующих моноцитов; он способен вызывать явления лизиса в плазматической мембране клеток эндотелия, инициируя их гибель по типу апоптоза . Следовательно, повышение активности фосфолипазы А2 в периферической крови беременных с обострением ГВИ коррелировало с содержанием продуктов ПОЛ и может являться прогностическим фактором в оценке степени деструктивных изменений мембранного аппарата, в том числе эритроцитов.

Заключение

Обострение ГВИ в период гестации приводит к интенсификации процессов ПОЛ, увеличению активности провоспалительного фермента фосфолипазы А2, способствует гидролизу мембранных фосфолипидов с образованием токсических продуктов лизофосфатидилхолина и арахидоновой кислоты; является причиной нарушения структурно-функционального состояния эритроцитов периферической крови беременных. Выявленные изменения наиболее выражены при титре антител IgG к ВПГ-1 1:12800. Полученные результаты исследования позволяют предположить, что изменения, происходящие в составе липидов периферической крови и активности фосфолипазы А2 при ГВИ, могут служить критериями для целенаправленной корригирующей терапии беременных с обострением ГВИ.

Библиографическая ссылка

Ишутина Н.А. АКТИВНОСТЬ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 И СОСТОЯНИЕ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БЕРЕМЕННЫХ С ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ // Успехи современного естествознания. – 2013. – № 2. – С. 12-14;
URL: http://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=31354 (дата обращения: 13.12.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»